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热休克蛋白(Hsps)作为一类“分子伴侣”，在生理状态下，与多种蛋白质在细胞中结合来参与蛋白质的折叠、装配及转运；在应激情况下，参与组织细胞抗损伤及自身保护，是细胞生存所必需的一类蛋白质。Hsp70是一个高度保守的蛋白，其在蛋白的转运、折叠以及抗原的加工提呈过程中均具有重要作用。研究表明，Hsp70可作为一种分子载体，增强与其结合蛋白的抗原性。汉滩病毒(HTNV)是肾综合征出血热的致病病毒汉坦病毒(HV)中的一型，其核蛋白(NP)具有很强的抗原性和免疫原性，诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应的靶细胞—巨噬细胞中存在NP抗原，NP抗原系CTL识别的主要抗原之一。本实验在本室过去证实HTNV感染实验动物体内Hsp70与NP存在形态共定位和蛋白分子相互结合的基础上，进一步研究了该感染模型中病毒NP、病毒囊膜糖蛋白G2与Hsp70、Hsp27及Grp94的相互关系，并在此基础上构建以Hsp70为载体、NP为靶抗原的针对HFRS的DNA疫苗，同时在原核体系中分析Hsp70的表达条件并诱导其高效表达。 1．HTNV感染中病毒蛋白与多个热休克蛋白的相互关系。将初生乳鼠脑内接种HTNV，取8d后发病死亡鼠脑组织制备石蜡切片以及组织匀浆 第四军医大学硕士学位论文液，免疫组化检测组织中病毒蛋白与HsP70、Hsp27及G印94的表达，用双抗体夹心EUSA、免疫共沉淀及Westem Blot方法分析病毒蛋白和以上多个HsPs的关系。结果发现病毒感染后组织中NP、GZ、HsP70及Grp94表达均有明显提高，Np与Hsp70、Hsp27、G印94及GZ与Np、Hsp27同时存在蛋白分子相互结合关系，形成Hsps一病毒蛋白复合物。 2.在真核体系中诱导表达Hsp70一P复合物。通过PCR方法突变NP的编码基因S的终止码得到S2，将其与hsp70基因连接并克隆入真核表达载体peDNA3.1(+)，构建peDNA3.1(+)/52一hsp7o。脂质体介导该融合表达质粒转染COs一7细胞，免疫组化检测NP一Hsp70复合物的表达情况。结果显示转染peDNA3.1(+)/52一hsP70的细胞胞浆中出现该复合物的表达。 3.在原核体系中高效表达Hsp70。将hsP70基因克隆到高效原核表达载体p入IAL一cZX中构建质粒pMAL一cZX/hsp70。转化大肠杆菌DH5a，用IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达。以SDS一PAGE及研七stem Blot检测并以凝胶薄层扫描分析表达水平。结果显示HsP70以融合蛋白形式出现表达，改变诱导的温度和时间目的蛋白表达总量及可溶性部分所占比例不同，本实验中Hsp70表达量最高的条件是IPTG终浓度为0.3~o比，37℃诱导sh，而可溶性表达的条件以20℃诱导ZOh，IPTG终浓度0.3~ol几为佳。 综上所述，本实验证明HTNV感染后有HsPs一病毒蛋白复合物形成，为研究HsPs在病毒感染复制中的作用以及抗病毒感染方面提供了实验资料;同时成功构建可表达Hsp7o一核蛋白复合物的融合真核表达质粒，并原核高效表达了HsP70，为针对HFRS的DNA疫苗的研制打下基础。