论文部分内容阅读
赖氨酸特异性去甲基化酶1（Lysine-specific demethylase 1,LSD1,又称KDM1A）是最早被报道的组蛋白去甲基化酶,该酶通过黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖性的酶催化氧化作用,实现H3K4me1/2和H3K9me1/2的单双去甲基化,从而参与细胞增殖、分化和细胞全能性的转录调控。研究表明,LSD1在多种癌症中异常过表达,如神经母细胞瘤、前列腺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管鳞状细胞癌和肝细胞癌等,可促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移,阻碍癌细胞分化进程,还与癌症的不良预后相关。因此,开发高效特异性LSD1抑制剂对抗癌治疗具有重要意义。本论文基于课题组前期工作,以M-1系列吲哚衍生物为基础,设计合成一系列新型LSD1抑制剂,通过生物活性评价、构效关系研究,发现了具有进一步研究价值的新化合物,并制备了动物实验样品。以Ⅱ-1p-1候选化合物为基础,设计并合成探针工具分子,为候选化合物的作用靶点确认和作用机制研究奠定了坚实的基础。一、LSD1抑制剂的设计以化合物M-1为基础,设计合成了以下三个系列具有LSD1抑制作用的衍生物。系列I:吡咯环替代吲哚环,考察吲哚骨架对其生物活性的贡献;系列II:以M-1为基础,设计合成新的磺酰胺类化合物,优化磺酰胺基,改善其LSD1抑制活性。系列III:针对系列II结构优化的候选化合物Ⅱ-1p-1,通过计算模拟分析和构效关系研究,针对磺酰苯基的氨基取代开展进一步的结构优化和生物活性的评价研究。二、LSD1抑制剂的合成及活性评价本论文在M-1的基础上,合成了三个系列共38个LSD1抑制剂,全部为新化合物,关键中间体及目标化合物均通过NMR、MS等数据进行了结构确证,目标化合物通过HPLC分析含量,其含量基本大于95%。通过课题组构建的LSD1抑制剂筛选平台,评价了目标化合物的LSD1抑制活性,分析了其构效关系。1.通过吲哚骨架的替换,设计合成3个新化合物,活性评价结果表明,其活性几乎全部消失,证明吲哚骨架在LSD1抑制活性中扮演重要角色。2.系列II中,设计合成包括苯磺酰基、甲磺酰基、环丙甲磺酰基等磺酰胺的21个新化合物。其LSD1抑制活性评价结果表明,大部分新合成的化合物均表现出了良好的LSD1抑制活性,苯磺酰胺类化合物的活性显著优于脂肪磺酰胺的活性,其IC50在0.099-1.380μM,相对先导化合物活性显著改善。其中,化合物Ⅱ-1p-1的IC50值为99 n M,是先导化合物的9.4倍(IC50=0.929μM)。3.基于化合物Ⅱ-1p-1的活性结果及系列II的构效关系研究结果,针对苯环的对位取代氨基开展了进一步的优化,设计合成新化合物14个。LSD1抑制活性评价结果表明,多数新合成的化合物均表现出对LSD1良好的抑制活性,IC50均在n M级别（除Ⅲa、Ⅲf、Ⅲg）,从49 n M到714 n M。其中,化合物Ⅲc(IC50=49 n M)和Ⅲd(IC50=69 n M),分别是先导化合物的19、13倍。同时,为了评价目标化合物在体内对LSD1的抑制活性和抗肿瘤作用,合成化合物Ⅲd 1 g,其HPLC含量大于99%。三、生物素标记探针的设计合成与活性评价吲哚类LSD1抑制剂是课题发现的第一个非单胺氧化酶类的不可逆LSD1抑制剂,为了进一步研究此类抑制剂与LSD1的作用机制,确认其作用靶点和作用模式,在LSD1抑制剂的基础上,通过8步反应设计合成了生物素标记的阳性探针、阴性探针5个,并通过NMR、MS等确定了其分子结构,且HPLC含量大于95%。阳性探针IV-1和IV-2的合成以化合物Ⅱ-1p-1为配体,生物素为报告基团,丁二胺和哌嗪为连接链合成,它们均表现出纳摩尔级别的LSD1抑制作用(IV-1:IC50=38.610 n M;IV-2:IC50=109.333 n M)。以3-氨基哌啶和3-氨基吡咯为连接链合成阴性探针IV-3和IV-4的IC50值降至微摩尔级,IC50为6.647和2.261μM。同时设计了将关键活性位点之一的11位羟基,通过乙酰化封闭得到的阴性探针Ⅳ-5,但是其对LSD1的IC50也达到了n M级的抑制活性(IC50=290 n M),活性显著优于其乙酰化的配体分子化合物13,其在10μM的抑制率仅为39.86%。探针IV-1-IV-4的结构和活性数据分析表明,磺酰基对位直线衍生对该类化合物的LSD1抑制活性有利,甚至可以成数十倍提高其生物活性。这为进一步的作用靶点确认和作用机制研究奠定了基础。综上所述,本课题通过对模型化合物M-1的吲哚环和苯磺酰基进行结构优化,共设计合成了38个新型LSD1抑制剂,大部分抑制剂具有纳摩尔级的抑制活性,其中,化合物Ⅱ-1p-1、Ⅲc、Ⅲd、Ⅲh对LSD1的IC50值小于100 n M,并制备1 g的动物实验样品。并在抑制剂Ⅱ-1p-1的基础上设计合成了5个生物素标记的探针,为该类LSD1抑制剂靶点确认和作用机制研究提供工具分子。