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理想的伤口敷料应保持伤口的湿润环境,允许气体渗透,但可有效阻挡外界灰尘和微生物。近年来,人们开发了很多类型的伤口敷料,包括海绵、薄膜、静电纺丝纳米纤维和水凝胶等。其中,水凝胶由于具有高含水率,形状可塑性及溶胀性能良好等一系列模拟天然细胞外基质的特性,已被广泛用于生物医学领域,作为药物输送系统、细胞三维培养的支架和伤口敷料等组织修复材料。氧化应激和细菌感染是影响伤口愈合进程的两大因素。在伤口愈合的炎症阶段产生的活性氧会引发毒性氧化反应,造成组织破坏,从而阻碍正常的愈合过程。基于酚类和类黄酮等抗氧化剂的伤口敷料可有效降低氧化应激水平。细菌感染是伤口愈合过程中最常见和最严重的挑战。抗菌水凝胶一般通过负载抗生素发挥作用,然而,过度使用抗生素会导致细菌耐药性的发生。因此,很多抗菌水凝胶将银纳米粒子等杀菌剂掺入水凝胶网络中,但大多数具有潜在的细胞毒性,它们的生物相容性是一个主要的问题,因此光热抗菌伤口敷料受到了更为广泛的关注。本研究首先在透明质酸（Hyaluronic acid,HA）主链上接枝酪胺（Tyramine）合成HT（Hyaluronic acid-Tyramine）聚合物,在明胶（Gelatin,GT）主链上接枝没食子酸（Gallic acid,GA）合成GGA（Gelatin-Gallic acid）聚合物。辣根过氧化物酶和双氧水（HRP/H2O2）催化HT与GGA的苯酚基交联,将氧化石墨烯（Graphene oxide,GO）粉末均匀分散在HT/GGA/GO水凝胶中。在HT/GGA天然高分子聚合物水凝胶网络中负载碳基材料GO,使HT/GGA/GO水凝胶敷料具有良好的光热抗菌性能。HT/GGA/GO水凝胶敷料对细菌表现出广泛的抗菌活性,包括大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。经扫描电镜观察,水凝胶为多孔交联的三维网状结构。各种理化实验表征,本研究所制备的水凝胶敷料具有良好的稳定性、生物相容性、抗氧化性和止血性能。此外,体内实验表明HT/GGA/GO水凝胶敷料结合光热疗法可有效避免伤口早期感染,进一步加速伤口愈合。以上结果共同表明,可注射抗氧化光热抗菌HT/GGA/GO水凝胶在伤口敷料领域中具有良好的应用前景。目的本研究以HT（透明质酸接枝酪胺）、GGA（明胶接枝没食子酸）和GO（氧化石墨烯）为原料,制备了一种可注射抗氧化光热抗菌水凝胶敷料。通过核磁氢谱、紫外吸收光谱证明HT与GGA的成功合成。各项体外表征实验证明HT/GGA/GO水凝胶具有良好的抗氧化性和光热转换性能,通过生物相容性测试证明水凝胶的生物安全性。利用大肠杆菌感染全层皮肤损伤模型小鼠测试该水凝胶作为皮肤伤口敷料的体内抗感染性能。随后通过免疫蛋白印迹和免疫荧光染色实验进一步验证了HT/GGA/GO水凝胶的体内抗感染特性。方法第一部分:HT/GGA/GO水凝胶的制备及性能表征首先,向透明质酸主链上接枝酪胺,透明质酸的羧基与酪胺的氨基脱水缩合形成酰胺键,合成HT聚合物。同样地,向明胶主链的氨基上接枝没食子酸,合成GGA聚合物。通过核磁共振氢谱表征HT和GGA的成功合成,通过紫外吸收光谱测定接枝率。HRP/H2O2可引发苯酚或苯胺衍生物产生自由基并发生偶联反应,因此我们使用过氧化氢（H2O2）和辣根过氧化物酶（HRP）催化HT和GGA的苯酚基氧化偶联形成HT/GGA骨架,将GO粉末均匀地分散在水凝胶中,制备HT/GGA/GO水凝胶。通过物理化学实验对HT/GGA/GO水凝胶的各项性能进行表征。通过剪切变稀实验证明HT/GGA/GO水凝胶的可注射性;通过小瓶倒置法测量水凝胶的成胶时间;通过冻干、溶胀和称重等物理方法测定水凝胶的含水量、溶胀比和体外稳定性;通过酶解法测量水凝胶的体外生物可降解性;通过流变学测试衡量水凝胶的机械性能,扫描电镜观察水凝胶的微观形貌;利用808 nm近红外光测量水凝胶的光热转换性能;利用革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌测定水凝胶的光热抗菌性能;通过测定水凝胶的直接抗氧化性和细胞抗氧化性评估水凝胶的抗氧化性能;通过浸提液接触法测定水凝胶的细胞相容性,通过直接接触法测定水凝胶的溶血率。第二部分:HT/GGA/GO水凝胶对感染全层皮肤损伤的促进愈合作用通过小鼠皮下注射法测定了水凝胶的体内生物可降解性和组织相容性:在注射后的第3、7和14天,取注射点附近组织和主要器官,H＆E染色后观察;通过两种出血模型评价了水凝胶的体内止血性能;在小鼠背部制造直径为8 mm的全层皮肤缺损伤口,利用大肠杆菌感染伤口,成功建立大肠杆菌感染全层皮肤损伤模型,将模型小鼠随机分为三组:Control组、HT1/GGA2/GO0组和HT1/GGA2/GO0.1组。在小鼠伤口表面注射相应的水凝胶,NIR照射10分钟。在治疗后第3、7和14天拍摄伤口照片,利用Image J软件分析伤口愈合率。取第14天的皮肤伤口组织进行H＆E染色和Masson三色染色,分析各组伤口的愈合程度。通过免疫蛋白印迹和免疫荧光染色定量分析伤口皮肤组织的炎症水平和血管新生程度。结果第一部分:HT/GGA/GO水凝胶的制备及性能表征1、HT和GGA聚合物的核磁共振氢谱、紫外吸收光谱均表现出苯酚基的特征吸收峰,通过紫外吸收光谱、酪胺含量和GA含量的标准曲线计算得出HT中酪胺的接枝率为4.72%,GGA中GA的接枝率为7.90%。即1 g HT中含有340μmol苯酚基团,1 g GGA中含有464.38μmol苯酚基团。通过HRP/H2O2催化体系HT与GGA的苯酚基氧化偶联形成水凝胶骨架,同时掺入GO制备了HT/GGA/GO水凝胶。2、HT/GGA/GO水凝胶具有可注射性,可应用于不规则伤口。水凝胶的成胶时间均在5分钟以内,有利于在急性皮肤损伤中的快速应用。水凝胶的含水量均大于90%,近似于细胞外基质。随着GO的加入,水凝胶的溶胀比增加,有利于吸收伤口渗出液。HT/GGA/GO水凝胶可在PBS溶液中稳定存在14天,可稳定应用于伤口敷料中;水凝胶在15 U/m L的透明质酸酶溶液中浸泡30分钟后完全降解,具有生物可降解性。流变测试结果表明各组水凝胶的储能模量G’均大于损耗模量G’’,证明水凝胶稳定形成的凝胶态;扫描电子显微镜观察结果显示水凝胶具有均匀的多孔结构。HT/GGA/GO水凝胶具有良好的光热转换性能,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有优良的光热抗菌特性,还具有良好的抗氧化性、细胞相容性和血液相容性。第二部分:HT/GGA/GO水凝胶对感染全层皮肤损伤的促进愈合作用1、HT/GGA/GO水凝胶具有良好的体内生物可降解性,H＆E染色和血生化分析结果表明其具有优良的组织相容性。两种止血模型的结果表明HT1/GGA2/GO0.1水凝胶具有良好的体内止血特性（P＜0.05）。2、对大肠杆菌感染伤口模型的促进愈合作用研究表明,水凝胶处理的伤口组织表现出更高的愈合率,其中HT1/GGA2/GO0.1水凝胶的效果最好,治疗14天后的伤口愈合率为91.49±2.47%（P＜0.05）;H＆E染色和Masson三色染色结果显示出更小的真皮间隙,更厚的肉芽组织和更规则、更致密的胶原沉积。免疫蛋白印迹和免疫荧光染色结果表明,水凝胶处理组的炎症水平降低（P＜0.05）,新生血管数量增加（P＜0.05）。结论1、本研究通过HRP/H2O2催化交联制备了可注射抗氧化光热抗菌HT/GGA/GO水凝胶。HT/GGA/GO水凝胶具有良好的可注射性、稳定性、机械性能,具有疏松多孔的结构和良好的光热抗菌性能、抗氧化性、生物相容性和生物可降解性。2、其中,HT1/GGA2/GO0.1水凝胶在体内能够快速、有效止血。该水凝胶结合NIR照射能显著抑制大肠杆菌的存活,预防伤口感染,减轻炎症,促进血管生成和全层皮肤感染创面的愈合。这些特性使HT/GGA/GO水凝胶在伤口敷料领域具有良好的应用前景。