去泛素化酶OTUD6B调控p VHL抑制肾透明细胞癌转移背景:肾细胞癌（Renal Cell Carcinoma）是起源于肾小管上皮的恶性肿瘤,根据2020年《World Cancer Report》中报告显示,在世界范围内,肾癌的发病率约占成人恶性肿瘤的3%,肾癌的组织病理类型最常见的为肾透明细胞癌（clear cell Renal Cell Carcinoma）,约占肾细胞癌的80%,并且在近几十年来,在大多数国家和地区肾癌的发病率都呈持续增长趋势。肾癌目前病因尚不明确,但是其发病与遗传、吸烟、肥胖、高血压等有关。其中遗传性肾癌占总数的2%~4%,多以常染色体显性遗传方式在家族中遗传,已经明确的遗传性肾癌包括VHL综合征、BHD综合征等。并且,除了遗传性肾细胞癌,在散发的肾透明细胞癌中,半数以上病例同样发现了存在VHL基因突变。我们实验室在过去的研究中发现去泛素化酶OTU亚家族中的OTUD6B在肝细胞癌中是一个肿瘤抑制基因,OTUD6B能够以不依赖其去泛素化酶活性的方式与VHL复合体相互作用并稳定p VHL,从而拮抗VHL-HIF信号通路,抑制肝细胞癌的转移。尽管通过研究揭示OTUD6B可以作为p VHL蛋白稳定性的正调控因子并在肝细胞癌癌中扮演抑癌因子的角色,但是它在肾透明细胞癌中是否存在相同的调节机制尚未可知。并且在肾透明细胞癌患者中,半数以上存在VHL突变,OTUD6B在这部分患者中是否还能发挥稳定p VHL蛋白的功能,与患者预后关系存在怎样的关系,我们对此进行了进一步研究。目的:探讨去泛素化酶OTUD6B在肾透明细胞癌中是否通过稳定p VHL来抑制其肿瘤发展;分析OTUD6B对肾透明细胞癌的增殖、迁移以及EMT影响;对于VHL突变型肾透明细胞癌OTUD6B能否继续发挥抑癌功能。方法:1)通过TCGA数据库获得肾透明细胞癌患者病理信息及OTUD6B和VHL的相关表达数据,分析OTUD6B的m RNA水平及VHL的蛋白水平与肿瘤转移及预后相关性。2)将TCGA数据库中肾透明细胞癌患者分为VHL突变组与野生组,分别分析OTUD6B的m RNA水平与两组患者生存与肿瘤转移相关性,并且将VHL突变组根据突变类型进一步划分,分析OTUD6B与不同类型突变组生存相关性。3)选择三种肾透明细胞癌细胞系（一种VHL-WT型ACHN细胞系,两种VHL移码突变型A498和786O细胞系）,靶向转染OTUD6B sh-RNA下调其水平。4)通过细胞迁移及增殖实验检测上述三种细胞系,观察敲低OTUD6B对三种肾透明细胞癌细胞迁移及增殖的影响。5)通过蛋白质印迹（western blot）方法检测三种细胞系敲低OTUD6B后p VHL、缺氧诱导因子HIF-2α以及相关上皮间充质转化（EMT）指标变化。6)根据VHL突变数据库,构建19种VHL热点突变质粒,在293T细胞中检测OTUD6B对点突变VHL调控,选择若干种点突变VHL进一步验证OTUD6B与这些点突变VHL是否具有相互作用以及能否影响其泛素化水平。结果:1)分析TCGA数据库中肾透明细胞癌患者病理信息,发现OTUD6B与VHL的m RNA水平与肿瘤转移情况及患者预后相关。2)对于VHL突变型肾透明细胞癌患者,OTUD6B的m RNA水平仍与肿瘤转移及预后相关。对于VHL不同突变类型而言,OTUD6B与VHL错义突变型患者预后相关。3)细胞增殖及迁移实验结果表明,在三种肾透明细胞癌细胞系中敲低OTUD6B,ACHN细胞系迁移能力上升（P＜0.05）,A498及786O细胞系迁移能力无明显变化,三种细胞系增殖能力均无影响。4)Western blot实验结果显示敲低OTUD6B之后,ACHN细胞系中p VHL和E-钙粘蛋白（E-cadherin）水平下降,HIF-2α与slug蛋白水平上升。而在A498与786O细胞系中,敲低OTUD6B,上述指标均无明显变化。5)在293T细胞中外转OTUD6B与热点VHL突变质粒,Western blot实验结果显示OTUD6B对于绝大多数点突变VHL蛋白依旧具有稳定作用,并减少其泛素化降解。结论:在肾透明细胞癌中OTUD6B可以通过稳定p VHL,下调HIF-2α水平,抑制细胞迁移,对于部分点突变的p VHL,OTUD6B依旧可以通过这种作用发挥抑癌功能。第二部分去泛素化酶OTUB2参与缺氧环境下肝细胞癌生长转移机制背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma）是肝癌的主要组织学亚型,占原发性肝癌的85%以上。乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、饮酒、黄曲霉毒素暴露、肝吸虫感染、肥胖等是肝癌的主要危险因素。我国作为世界肝癌发病人口最多的国家,尽管近些年对于肝癌预防和治疗工作不断提升完善,但是肝癌的防治情况仍不容乐观。肝细胞癌作为实体肿瘤之一,其内部往往存在缺氧微环境,缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor）作为肿瘤缺氧反应中关键性因子,可以调节肿瘤新生血管生成、能量代谢、细胞增殖、浸润和转移等相关基因,导致肿瘤恶性程度的增加和肿瘤生物学行为的改变。过去有文献提及去泛素化酶OTU家族可能受缺氧信号调节,在缺氧条件下表达上升。OTUB2作为去泛素化酶OTU家族中的一员,在近些年来的文献中也在频繁报道,参与了包括甲状腺癌,子宫内膜癌等多种肿瘤的发生发展,但是关于其在肝癌中的功能还有待进一步探究。目的:探讨OTUB2在肝癌与正常肝组织中表达情况,对肝细胞癌患者预后影响,以及其在肝细胞癌发展中的作用,并且通过肝癌细胞系缺氧环境下培养,探究HIF对OTUB2的调控。方法:1)通过TCGA数据库分析OTUB2在肝细胞癌与正常组织中m RNA表达水平,分析其水平高低与患者预后关系。2)通过免疫组织化学（immunochemistry,IHC）方法检测98例肝细胞癌组织和39例癌旁正常组织的OTUB2蛋白表达情况,分析其蛋白水平与患者病理相关信息关系。3)通过TCGA数据分析OTUB2与HIF相关下游靶基因m RNA水平的相关性。4)缺氧培养SMMC7721以及LM3肝癌细胞系,western blot检测其HIF及OTUB2蛋白水平变化。5)加入地高辛处理后再进行缺氧培养SMMC7721以及LM3肝癌细胞系,western blot检测其HIF及OTUB2蛋白水平变化。结果:1)分析TCGA数据库中369例肝细胞癌与50例正常肝组织OTUB2的m RNA水平,发现OTUB2的m RNA在癌中表达明显高于正常组织,并与患者预后相关,表达高者患者预后更差。2)免疫组织化学分析显示,与正常肝组织相比,OTUB2在肝细胞癌组织中表达明显更高（P＜0.05）。在40例正常肝组织阳性表达率为22.5%（9/40）,98例肝细胞癌组织中阳性表达率为79.6%（78/98）,且差异具有统计学意义（P＜0.001）。3)TCGA分析结果显示OTUB2与HIF相关靶基因的m RNA水平存在正相关,推测OTUB2可能也是HIF靶基因之一。4)缺氧环境培养肝癌细胞系,经western blot检测结果显示,随缺氧时间延长而升高,HIF-2α和OTUB2蛋白水平也随之升高。5)加入地高辛处理后再进行缺氧培养,抑制了HIF-2α蛋白水平,同时发现OTUB2蛋白水平随缺氧时间延长不升反降。结论:在肝细胞癌中,OTUB2的m RNA和蛋白均高表达,并且可能作为下游靶基因之一受HIF-2α调控,参与缺氧环境下肝细胞癌的进展。