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研究背景及目的:中间丝蛋白巢蛋白Nestin在神经上皮细胞和中枢神经系统(central nervous system,CNS)中的神经干细胞(Neural stem cell,NSCs)、星形胶质细胞(Astrocytes,AS)中表达。神经干细胞具有自我更新和多向分化潜能,能够分化为神经元(Neurons)、星形胶质细胞和少突胶质细胞(Oligodendrocytes)。研究表明,在神经系统发育过程中,Nestin的表达是动态变化的:胚胎期,神经前体细胞暂时表达Nestin,以后逐渐被胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP,星形胶质细胞的标记物)、β-微管蛋白-Ⅲ(β-3-tublin,神经元标志物)等所替代。一直以来,Nestin被认为是神经干细胞的标志物,近年来也有越来越多的研究表明Nestin不仅是细胞标志物,更是一种功能蛋白。基于这个背景,本篇论文针对Nestin巢蛋白对神经干细胞和星形胶质细胞的增殖分化功能的影响进行研究。我们首先检测Nestin在小鼠脑中不同时间和空间的表达,了解其表达模式;然后通过基因转导以及基因过表达和敲除改变Nestin蛋白的表达水平,研究其在神经干细胞和星形胶质细胞中的功能,加深对Nestin蛋白的了解,通过其在神经干细胞及星形胶质细胞增殖分化方面的作用,更证实了其在神经损伤修复及治疗神经退行性疾病方面的潜力。研究方法:1.收集胚胎期及出生后不同时间点的C57品系的wild type(WT)小鼠完整脑切片进行免疫荧光染色,观察Nestin在时间和空间的表达模式。2.在体外建立神经干细胞培养体系,通过免疫荧光检测神经干细胞贴壁培养后的纯度,即利用神经干细胞标志物Nestin,星形胶质细胞标志物S100,神经元标志物Tuj1,少突胶质细胞标志物O4进行免疫荧光染色,最终得到纯的神经干细胞应满足Nestin阳性表达,S100、Tuj1、O4阴性表达的条件;同时采用流式分选的方法检测悬浮神经干细胞的纯度,即利用神经干细胞流式筛选的抗体CD133,星形胶质细胞流式筛选抗体ACSA2,少突胶质细胞流式筛选抗体O4以及神经元流式筛选抗体PSA-NCAM共同进行筛选检测,最终得到纯的神经干细胞应满足CD133阳性表达,ACSA2、PSA-NCAM、O4阴性表达的条件。3.检测原代培养的神经干细胞是否具有增殖和分化潜能。在P1、P2天的WT幼鼠大脑中提取神经干细胞,体外培养,观察其成球情况;消化成单细胞后贴壁培养,并加入血清进行诱导分化3-5天,利用免疫荧光检测分化为星形胶质细胞(S100+),神经元(β-3-tublin/Tuj1+)和少突胶质细胞(O4+)的情况。4.构建Nestin沉默及过表达质粒,进行慢病毒包装,并通过慢病毒感染神经干细胞敲低及过表达Nestin,利用免疫荧光检测后NSCs增殖的变化(Ki67)以及对分化方向的影响(Tuj1/S100)。5.在P6、P7或P8天左右的WT小鼠的小脑中提取星形胶质细胞,通过免疫荧光检测其纯度(S100+)及体外增殖情况,通过慢病毒感染星形胶质细胞沉默Nestin,并利用免疫荧光检测对其增殖的影响。6.探索影响星形胶质细胞增殖的原因,通过免疫荧光检测Sonichedgehog(Shh)信号通路对其增殖是否有影响。同时取P8天Ptch1-lacz小鼠的脑切片,通过β-gal(β-半乳糖苷酶)活性检测反应lacz基因表达变化从而检测ptch1是否表达即检测Shh信号通路是否活化,同时也检测其体内增殖情况。7.收集正常及Nestin缺失小鼠小脑的星型胶质细胞进行体外培养,并加入Shh蛋白进行处理后,利用免疫荧光检测其Nestin蛋白表达及增殖情况。结果:1.免疫荧光结果表明Nestin蛋白在小鼠的小脑的分子层,大脑的脑室区、海马区等部分广泛分布,主要在神经干细胞以及星形胶质细胞中表达,Nestin阳性表达的结构多为纤细的丝状纤维突起,分布密集,分布相对比较均匀。2.原代提取的NSCs在体外能够自我更新形成神经球并在血清诱导72小时分化完全的情况下,利用免疫荧光检测结果显示NSCs分化为74%的星形胶质细胞(S100),21%的神经元(Tuj1)以及5%的少突胶质细胞(04)。3.利用免疫荧光检测神经干细胞贴壁后的纯度,结果显示Nestin+/S100-/Tuj1-的细胞比例为37%,同时经流式筛选检测悬浮的神经干细胞的纯度,即CD133+/ACSA2-/O4-/PSA-NCAM-的细胞比例为32.3%,两者差距不大,证明体外提取神经干细胞的纯度为30%左右。4.慢病毒Nestin-shRNA感染NSCs,沉默Nestin蛋白,免疫荧光检测结果显示NSCs增殖减慢,同时加血清诱导NSCs分化后,Nestin沉默后的NSCs分化为神经元的比例增加至30.5%。相反的当过表达Nestin蛋白时,免疫荧光检测过表达Nestin组的NSCs向神经元分化比例明显下降。5.通过免疫荧光检测原代星形胶质细胞的纯度为90%以上(S100+),体外增殖水平在20%左右,并且,免疫荧光检测星形胶质细胞在Nestin沉默的情况下,增殖水平降低。6.进一步研究发现,星形胶质细胞体内外的增殖依赖Shh信号通路,当通路受到抑制时增殖水平明显下降。7.免疫荧光检测星形胶质细胞Nestin缺失后影响其对Shh蛋白的反应能力,因此导致增殖水平降低。实验结论:Nestin蛋白在幼年小鼠脑部广泛分布,并且在神经干细胞及星形胶质细胞中高表达,其蛋白水平影响两者的发育、增殖能力和干细胞的分化方向:当神经干细胞的Nestin水平降低时,其增殖能力明显下降,并且有诱导其定向分化为神经元的作用;Nestin高表达时,其向星型胶质细胞分化比例增加。对于星形胶质细胞来说,其体内外增殖都依赖Shh信号通路,Nestin缺失后影响了其对Shh信号通路的反应能力进而导致增殖水平明显下降。