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钩吻作为传统的中草药,具有多种生物学功能,同时在养殖生产中也有一定的应用,钩吻对畜禽具有促生长、减少料肉比和增强免疫力等功效,但在水产养殖中的应用研究未见报,因此对钩吻在水产养殖中进行应用研究显得尤为必要。钩吻具有一定的毒性,其毒性及作用机理的研究报道较少。因此,对钩吻在水产动物中的毒性研究有助于推动钩吻在水产养殖中的应用。本研究利用模式生物嗜热四膜虫和斑马鱼研究钩吻对水产动物的毒性影响,并将钩吻总碱作为饲料添加剂,同时研究总碱对团头鲂的生长和免疫性能的影响。本研究首先以嗜热四膜虫为模型,研究钩吻单体钩吻素子和钩吻素甲对真核微生物的毒性作用。我们发现钩吻素子和钩吻素甲以剂量依赖的方式抑制嗜热四膜虫的生长及其细胞活性。此外,钩吻素子和钩吻素甲在嗜热四膜虫细胞中引起了氧化应激反应,导致了ROS产生的增加,从而导致SOD、POD、CAT和GSH-PX在内的抗氧化酶的表达显著升高(P<0.05)。在高浓度下,钩吻素子还引起了嗜热四膜虫细胞的凋亡(P<0.05)。钩吻素子和钩吻素甲可以诱导嗜热四膜虫细胞的DNA损伤,而且这种损伤是存在剂量依赖性的。同时,钩吻素子和钩吻素甲还能够使嗜热四膜虫的线粒体空泡化的现象。钩吻素子和钩吻素甲能够显著影响氧化应激相关基因ATG7、MTT2/4、CYP1和HSP70以及MAP激酶途径基因MPK1和MPK3的表达。为了进一步了解钩吻素子和钩吻素甲对四膜虫的作用机理,我们进行了转录组分析。从转录组的结果发现钩吻素子组的差异基因主要富集在了一些氨基酸的代谢通路中,而钩吻素甲的差异基因主要富集在谷胱甘肽代谢通路中。因此,钩吻素子可能影响了嗜热四膜虫相关氨基酸的代谢,而氨基酸代谢的异常导致了氧化应激反应,氧化应激导致了嗜热四膜虫细胞的凋亡和DNA损伤等一系列毒性反应,而钩吻素甲引起的氧化应激可能和谷胱甘肽代谢异常有关。虽然用嗜热四膜虫对钩吻素子和钩吻甲的作用机理进行了初步的探索,但作为单细胞生物的嗜热四膜虫和鱼类无论是生理还是结构上都具有较大的差异,因此利用斑马鱼作为研究对象对钩吻的毒性机理进行研究十分必要。我们利用转录组和代谢组结合的方法研究钩吻素子对斑马鱼的毒性机理。在转录组分析中,通过KEGG富集分析发现三组差异基因均主要富集在了嘧啶代谢等核苷酸代谢通路上,同时氨基酸和脂类代谢相关的通路在KEGG中也得到了富集。而在代谢组的分析中也发现差异代谢物主要富集在一些氨基酸代谢相关的通路中,脂类代谢和嘧啶代谢相关通路也得到富集。从转录组和代谢组联合分析的结果可以得出,钩吻素子可能首先影响了斑马鱼氨基酸的代谢,同时影响了糖酵解/糖异生途径,进而对嘧啶等相关核苷酸代谢产生影响,另外氨基酸代谢的异常也影响了谷胱甘肽的代谢,进而激活了斑马鱼的抗氧化系统。在团头鲂的养殖实验中,我们发现饲料中添加钩吻总碱能显著提高最终体重(FBW)、增重率(WGR)和特定生长率(SGR)等生长指标(P<0.05),同时也可以改善饲料转化率(FCR)和蛋白质效率比(PER)等饲料利用率指标(P<0.05)。另外,20 mg/kg和40 mg/kg处理组的全鱼和肌肉的粗蛋白和粗脂肪含量均显著高于对照组,同时钩吻总碱的添加也可以增加肌肉中各种氨基酸的含量(P<0.05)。钩吻总碱对团头鲂血浆中的乳酸脱氢酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、总蛋白含量均有显著影响(P<0.05)。在20 mg/kg和40 mg/kg处理组中,血浆补体3、补体4和免疫球蛋白M含量显著增加(P<0.05),同时肝脏和血浆的抗氧化酶(SOD、CAT和T-AOC)和丙二醛含量显著升高(P<0.05)。另外,钩吻总碱能够引起肝脏、脾脏和头肾中IL-1β、IL8、TNF-α和IFN-α的m RNA水平显著上调和TGF-β和IL10基因表达水平显著下调(P<0.05)。钩吻总碱还能显著提高嗜水气单胞菌攻毒后团头鲂的存活率(P<0.05)。这些结果表明,钩吻总碱可以提高团头鲂生长性能、脂质和氨基酸沉积、免疫能力和对嗜水气单胞菌的抗性。因此钩吻总碱可以作为优良的免疫增强剂和生长促进剂在水产养殖中应用。此外,我们还研究了钩吻总碱对鱼类肠道状态及其肠道微生物的影响。研究发现钩吻总碱在40 mg/kg浓度可以通过增加前肠和中肠的绒毛长度、肌层厚度和绒毛数来改善肠道形态,促进营养的吸收(P<0.05)。钩吻总碱还通过增加超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、总抗氧化能力和丙二醛水平以及上调肠道铜锌超氧化物歧化酶和锰超氧化物歧化酶基因的表达(P<0.05)来提高肠道抗氧化能力。此外钩吻总碱还可以通过上调促炎性细胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α和IFN-α以及下调抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β的表达提高肠道免疫功能(P<0.05)。团头鲂肠道的Toll样受体基因Toll1、3、4和7的表达也得到显著上调(P<0.05),表明钩吻总碱可能通过TLR激活肠免疫应答。此外,本研究还表明饲喂钩吻总碱后团头鲂的肠道微生物菌群发生了改变。在门水平下,Proteobacteria的相对丰度增加,Firmicutes的相对丰度下降(P<0.05)。在属水平下,钩吻生物碱还增加了益生菌Rhodobacter的相对丰度,降低了病原菌Staphylococcus的相对丰度(P<0.05),同时增强其抵御外源病菌的入侵能力。我们还发现钩吻总碱影响肠道微生物的代谢途径,并且与氨基酸、脂肪酸和糖代谢相关。另外,Bug Base表型预测进一步表明钩吻总碱提高了肠道微生物群的抗氧化能力。对肠道微生物的研究更进一步揭示了钩吻总碱对团头鲂的作用机理,有助于推动钩吻在水产养殖中的研究应用。