研究背景和目的将具有肿瘤抗原特异性的T淋巴细胞输入病人体内的过继性T细胞疗法(Adoptive T cell therapy,ACT),已成为肿瘤生物治疗的一个重要手段。传统制备用于过继性治疗的T细胞的方法主要有两种:一种是从肿瘤浸润淋巴细胞中分离肿瘤抗原特异性的细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL);另一种是利用相应的肿瘤抗原刺激后,从病人外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中分离肿瘤抗原反应性的CTL。但是,这两种制备方法有一个共同之处,即要将分离到的CTL克隆进行体外的培养和增殖,以达到治疗所需的细胞数量。这种培养既耗时,技术要求又很高,临床上常常难以实现,因此成为制约过继性T细胞疗法推广与应用的关键环节之一。由于T细胞的抗原识别特异性是由其表面的抗原识别受体(T cell receptor,TCR)所决定,在细胞免疫中发挥着重要的靶向性作用,因此利用转基因的方法将具有肿瘤抗原特异性识别的TCR基因转入普通的T细胞中,实现T细胞的重定向(Redirection),将能够赋予该T细胞以抗肿瘤的能力,接纳了外源TCR基因的CD8+T细胞能够表现出与该TCR基因来源的CTL 一样的抗原反应活性。随着近年来研究的不断深入,目前利用抗原特异性TCR基因修饰T细胞进行过继性移植/回输,已经成为肿瘤生物治疗中的一个热点。这种快速制备肿瘤反应性T细胞的方法不仅解决了 CTL克隆在体外大量扩增培养的困难,而且所获细胞的肿瘤特异性与 LAK 细胞(lymphokine-activated killer cell)、CIK 细胞(Cytokine-induced killer)相比又高了很多,最大程度上降低了治疗的副作用,为抗原特异性T细胞过继治疗的应用和推广奠定了基础。尽管上述研究表明了 TCR基因治疗的可行性与临床应用前景,但有效治疗率的偏低也表明此方法存在需要改进的地方:第一,首先要解决的是外源TCR分子在宿主T细胞表面的分子表达密度。第二,解除体内肿瘤微环境对TCR基因修饰T细胞的抑制效果,提高其在体内的存活和增殖。针对上述需要改进之处,一些研究者进行了相关的探索。有研究者从蛋白翻译水平着手,分析密码子使用频率,针对黑色素瘤抗原特异性TCR基因的mRNA密码子进行优化,有效提高了外源TCR分子的表达水平,增强了抗肿瘤的效果。一些研究者尝试将抗细胞凋亡分子bcl-2、bcl-xl共同转入T细胞,抑制因肿瘤细胞分泌TGFβ而诱导的T细胞凋亡,提高TCR基因修饰T细胞在体内的增殖能力,增强了其抗肿瘤功能。以上提高TCR基因治疗效果的策略都依赖于高效转染T细胞的载体系统。目前基因治疗中常用的载体为逆转录病毒载体和腺病毒载体。由于逆转录病毒因整合宿主细胞基因组而存在致瘤风险,而腺病毒载体因具有感染增殖和非增殖细胞、不整合宿主细胞基因组、能同时表达多个外源基因等优点,已逐渐在基因治疗中发挥重要作用。腺病毒感染细胞的过程起始于腺病毒纤毛(fiber)结合细胞表面的特异性受体。腺病毒的纤毛由尾巴(tail)、杆(shaft)、头节(knob)三部分组成,与细胞表面受体直接相互作用的部分为纤毛头节。血清型5型腺病毒(Ad5)因遗传背景最为清晰,成为目前基因治疗中最常用的腺病毒载体,其识别的细胞表面天然受体为柯萨奇受体(coxsackie receptor,CAR)。由于T细胞表面科萨奇受体(CAR)表达水平低或缺失,导致Ad5针对其感染效率极低,无法满足科研及临床应用的需要,因此构建高效感染T细胞的腺病毒载体具有重要的意义;35型腺病毒(Ad35),其识别细胞的天然受体为CD46分子,而CD46在人绝大部分细胞中均高表达。因此,利用分子生物学的方法对5型腺病毒纤毛基因进行替换,形成具有35型腺病毒纤毛的嵌合型腺病毒载体Ad5F35,可以有效提高腺病毒感染T细胞的效率。Ad5的纤毛杆(shaft)由22个β重复(β repeats)构成;Ad35的纤毛杆仅含有6个β重复。目前国内外构建的Ad5F35,其纤毛均使用Ad35的纤毛杆,即Ad5F35S。为了研究纤毛杆对嵌合型腺病毒Ad5F35感染T淋巴细胞效率的影响,本研究分四个部分进行,首先构建了一种新型嵌合型腺病毒Ad5F35L,其纤毛使用Ad5的纤毛杆。Ad5F35L与Ad5F35S都具有Ad5的特性,同时还具有Ad35的头节(knob)部分;接着比较Ad5F35L、Ad5F35S感染T细胞(细胞株与原代细胞)效率,并对Ad5F35L感染T细胞的细胞毒性进行分析;然后在病毒与细胞结合、病毒经胞吞进入细胞、病毒裂解胞内体膜三个方面,分析Ad5F35L与Ad5F35S的差别,对纤毛杆影响Ad5F35感染T细胞效率的机制进行了初步研究;最后我们研究了 T细胞增殖状态对Ad5F35L感染T细胞的影响;研究内容与主要结果第一部分 嵌合型腺病毒Ad5F35L的构建1、细菌内同源重组法构建两种嵌合型骨架载体pBHG-F35L和pBHG-F35S2、重组穿梭载体的构建3、嵌合型腺病毒Ad5F35S与Ad5F35L的包装主要结果:本研究采用细胞内同源重组方法包装腺病毒,该包装系统中有一个骨架载体,其包含了腺病毒大部分基因组序列,大小近40 kb。欲对骨架载体上纤毛基因进行替换,采用酶切、连接的方法进行替换儿乎无法实现。本实验采用细菌内同源重组方法,首先在体外通过重叠PCR完成同源左臂、同源右臂与Ad5 shaft/Ad35 knob、Ad35 shaft/Ad35 knob片段的融合,同源左臂、右臂的长度分别为 1000 bp 和 2000 bp。从实验结果来看,Ad5 shaft/Ad35 knob、Ad35 shaft/Ad35 knob与同源左臂、右臂成功融合;病毒骨架载体中Ad5 fiber基因被成功替换为新的嵌合纤毛 Ad5 tail/Ad5 shaft/Ad35 knob 与 Ad5 tail/Ad35 shaft/Ad35 knob;嵌合型腺病毒Ad5F35L、Ad5F35S在HEK293细胞中成功包装,病毒滴度测定表明Ad5F35L、Ad5F35S病毒滴度较Ad5没有明显改变,说明病毒粒子在感染、包装等生理活动均显示正常,为下一步研究Ad5F35L、Ad5F35S对靶细胞感染研究奠定基础。第二部分 嵌合型腺病毒Ad5F35L感染T淋巴细胞效率及细胞毒性分析1、Ad5F35L感染淋巴瘤细胞株效率2、Ad5F35L感染原代CD8+T/CD4+T细胞效率3、Ad5F35L感染活化后的CD8+T/CD4+T细胞效率4、Ad5F35L在T细胞中表达时间分析5、Ad5F35L介导TCR基因在T细胞中表达6、Ad5F35L感染靶细胞的受体谱分析7、Ad5F35L感染T细胞毒性分析主要结果:本实验中选取Jurkat细胞、K562细胞、原代T细胞等作为靶细胞,对不同MOI值(低MOI值20到高MOI值400)感染条件下,分析Ad5F35L感染靶细胞的情况,通过流式分析GFP阳性表达的比例对感染效率进行评价。不同类型的腺病毒间感染K562细胞效率差异有显著性意义(F=232.32,P=0.000)。不同MOI值间,腺病毒感染K562细胞效率差异有显著性意义(F=225.66,P=0.000)。MOI值和腺病毒之间存在交互作用(F=24.82,P=0.000)。单独效应:固定MOI值进行不同类型腺病毒的比较,结果显示MOI5和MOI10间差异无统计学意义,其他组间比较差异均有统计学意义。多重比较显示除MOI50时Ad5F35S与Ad5F35L组间无统计学差异,其他组间差异有统计学意义时Ad5F35S和Ad5F35L均显著高于Ad5,且Ad5F35L显著高于Ad5F35S。不同类型的腺病毒间感染Jurkat细胞效率差异有显著性意义(F=127.007,P=0.000)。不同MOI值间,腺病毒感染Jurkat细胞效率差异有显著性意义(F=197.444,P=0.000)。MOI值和腺病毒之间存在交互作用(F=5.74,P=0.000)。单独效应:固定MOI值进行不同类型腺病毒感染Jurkat细胞效率的比较,结果显示MOI5组间差异无统计学意义,其他组间比较差异均有统计学意义。多重比较显示除MOI10、MOI50时Ad5F35S与Ad5F35L组间无统计学差异,其他组间差异有统计学意义时Ad5F35S和Ad5F35L均显著高于Ad5,且Ad5F35L显著高于Ad5F35S。在对原代T细胞的感染中,我们对CD8+T细胞/CD4+T细胞进行了分析,不同类型的腺病毒间感染CD8+T细胞效率差异有显著性意义(F=73.96,P=0.000)。不同MOI值间,腺病毒感染CD8+T细胞效率差异有显著性意义(F=44.04,.P=0.000)。MOI值和腺病毒之间存在交互作用(F=8.7,P=0.000)。单独效应:固定MOI值进行不同类型腺病毒感染CD8+T细胞效率的比较,结果显示MOI20组间差异无统计学意义,其他组间比较差异均有统计学意义。多重比较显示除MOI50、MOI100时Ad5F35S与Ad5F35L组间无统计学差异,其他组间差异有统计学意义时Ad5F35S和Ad5F35L均显著高于Ad5,且Ad5F35L显著高于Ad5F35S;固定不同类型腺病毒时进行不同MOI值的比较,结果显示随着MOI值的增长,Ad5F35L、Ad5F35S感染细胞效率也基本出现明显增长。腺病毒Ad5F35S与Ad5F35L感染CD8+T细胞效率较Ad5大幅提高,在MOI值200及以上时,Ad5F35L感染CD8+T细胞效率高于Ad5F35S。不同类型的腺病毒间感染CD4+T细胞效率差异有显著性意义(F=760.35,P=0.000)。不同MOI值间,腺病毒感染CD4+T细胞效率差异有显著性意义(F=238.37,P=0.000)。MOI值和腺病毒之间存在交互作用(F=61.16,P=0.000)。单独效应:固定MOI值进行不同类型腺病毒感染CD4+T细胞效率的比较,结果组间比较差异均有统计学意义。多重比较显示除MOI20、MOI50、MOI100时Ad5F35S与Ad5F35L组间无统计学差异,其他组间差异有统计学意义时Ad5F35S和Ad5F35L均显著高于Ad5,且Ad5F35L显著高于Ad5F35S;固定不同类型腺病毒时进行不同MOI值的比较,结果显示随着MOI值的增长,Ad5F35L、Ad5F35S感染细胞效率也基本出现明显增长。腺病毒Ad5F35S与Ad5F35L感染Donor A来源刺激活化后的CD4+T细胞效率较Ad5大幅提高,在MOI值200及以上时,Ad5F35L感染CD4+T细胞效率高于Ad5F35S。原代CD8+T细胞/CD4+T细胞经抗体、细胞因子刺激活化后,不同类型的腺病毒间感染活化后CD8+T细胞效率差异有显著性意义(F=176.72,P=0.000)。不同MOI值间,腺病毒感染活化后CD8+T细胞效率差异有显著性意义(F=77.23,P=0.000)。MOI值和腺病毒之间存在交互作用(F=21.83,P=0.000)。单独效应:固定MOI值进行不同类型腺病毒感染活化后CD8+T细胞效率的比较,结果显示MOI20组间差异无统计学意义,其他组间比较差异均有统计学意义。多重比较显示除MOI50、MOI100时Ad5F35S与Ad5F35L组间无统计学差异,其他组间差异有统计学意义时Ad5F35S和Ad5F35L均显著高于Ad5,,且Ad5F35L显著高于Ad5F35S;固定不同类型腺病毒时进行不同MOI值的比较,结果显示随着MOI值的增长,Ad5F35S、Ad5F35L感染细胞效率也基本出现明显增长。腺病毒Ad5F35S与Ad5F35L感染刺激活化后的CD8+T细胞效率较Ad5大幅提高,在MOI值200及以上时,Ad5F35L感染CD8+T细胞效率高于Ad5F35S。不同类型的腺病毒间感染活化后CD4+T细胞效率差异有显著性意义(F=760.35,P=0.000)。不同MOI值间,腺病毒感染活化后CD4+T细胞效率差异有显著性意义(F=238.37,P=0.000)。MOI值和腺病毒之间存在交互作用(F=61.16,P=0.000)。单独效应:固定MOI值进行不同类型腺病毒感染活化后CD4+T细胞效率的比较,结果组间比较差异均有统计学意义。多重比较显示除MOI20、MOI50、MOI100时Ad5F35S与Ad5F35L组间无统计学差异,其他组间差异有统计学意义时Ad5F35S和Ad5F35L均显著高于Ad5,且Ad5F35L显著高于Ad5F35S;固定不同类型腺病毒时进行不同MOI值的比较,结果显示随着MOI值的增长,Ad5F35L、Ad5F35S感染细胞效率也基本出现明显增长。腺病毒Ad5F35S与Ad5F35L感染刺激活化后的CD4+T细胞效率较Ad5大幅提高,在MOI值200及以上时,Ad5F35L感染CD4+T细胞效率高于Ad5F35S。成功原核表达纤毛蛋白,并通过纤毛蛋白竞争性抑制实验证明Ad5F35L通过与Ad35相同的受体结合而进入靶细胞;利用pull down结合蛋白质谱鉴定的方法,筛选到一批Ad5F35L新的候选受体;Ad5F35S介导GFP在T细胞中的表达时间为9天,而Ad5F35L介导GFP在T细胞中的表达时间可持续到第11天。在细胞凋亡分析中,腺病毒Ad5F35L感染Jurkat细胞后,不同时间点细胞凋亡比例差异有显著性意义(F=54.537,P=0.000);不同MOI值间,腺病毒感染Jurkat细胞后细胞凋亡比例差异有显著性意义(F=24.919,P=0.000)。MOI值和感染时间之间存在交互作用(F=10.194,P=0.000)。单独效应:固定不同时间点进行不同MOI值的比较,结果显示随着MOI值的增长,除24hMOI400外细胞凋亡基本呈现增长的趋势。感染后72 h时,对照组凋亡比例为4.4%,MOI值为200时凋亡比例为16.73%,两者差异有显著性意义(p=0.000);MOI值为400时,凋亡比例为20.5%,两者差异有显著性意义(p=0.00.0),提示感染后72 h,MOI值为200、400会导致细胞凋亡比例明显增加;因此在以Jurkat细胞为靶细胞的感染中,如果实验时间超过48 h,建议使用MOI值100进行感染。Ad5F35L感染原代T细胞后,不同时间点细胞凋亡比例差异有显著性意义(F=79.280,P=0.000);不同MOI值间,腺病毒感染T细胞后细胞凋亡比例差异有显著性意义(F=9.316,P=0.000)。MOI值和感染时间之间存在交互作用(F=2.241,P=0.037)。单独效应:固定MOI值只进行不同时间细胞凋亡的比较,结果组间差异有统计学意义。组间差异有意义时进行多重比较,结果显示48h、72h基本高于24h,72h基本高于48h;固定不同时间点进行不同MOI值的比较,结果显示随着MOI值的增长,除24h和72h的MOI200,细胞凋亡基本呈现增长的趋势。腺病毒Ad5F35L感染T细胞后72 h时,未感染的对照组凋亡比例为22.63%,MOI值为400时,凋亡比例为33.9%,两者差异有显著性意义(p=0.000),提示感染后72 h,MOI值为400会导致明显的细胞凋亡。如果以原代T细胞为靶细胞,如果实验时间超过48 h,建议使用MOI值200进行感染。同时,Ad5F35L感染T细胞并未引起细胞周期阻滞。第三部分 纤毛杆影响Ad5F35感染T细胞效率机制的初步研究1、纤毛杆对病毒与细胞结合的影响2、纤毛杆对病毒胞吞进入细胞的影响3、纤毛杆对病毒诱导膜裂解的影响4、纤毛杆对发生逆向胞吐的病毒数量的影响主要结果:纤毛杆影响Ad5F35感染T细胞效率主要来自两个方面:病毒诱导胞内体膜裂解、病毒进入细胞后的逆向运输。对于Ad5F35L和Ad5F35S而言,与T细胞结合的病毒数量没有差别(t=1.976,P=0.119),经胞吞进入细胞的病毒数也没有差别(t=0.451,P=0.675),或者说相同的病毒结合细胞后,相同数量的病毒经胞吞进入到细胞内;进入到细胞后,Ad5F35L裂解胞内体的能力强于Ad5F.35S,更多的Ad5F35L病毒进入到细胞质,而更多Ad5F35S病毒粒子可能停留在溶酶体中,甚至被溶酶体降解,这就导致进入到细胞质的两种病毒粒子发生了差别,进入到细胞质的Ad5F35L粒子较Ad5F35S更多;另外,病毒进入到细胞质后,Ad5F35L、Ad5F35S均有部分病毒并未朝着细胞核运输,而是可能通过囊泡运输至细胞膜并胞吐至胞外,我们的实验表明,病毒感染后6 h,胞吐至胞外的Ad5F35S病毒数更多(t=3.645,P=0.005),进入细胞核的Ad5F35S病毒数进一步减少,因此导致了 Ad5F35S、Ad5F35L感染T细胞效率的差别。第四部分 细胞增殖状态对Ad5F35L感染T细胞效率的影响1、低血清培养能导致细胞增殖状态的改变2、抑制靶细胞增殖会导致Ad5F35L感染Jurkat细胞效率降低3、抑制靶细胞增殖降低Ad5F35L感染效率的机制研究(1)抑制靶细胞增殖并未影响病毒与细胞的结合(2)抑制靶细胞增殖导致经胞吞进入细胞的病毒数量减少(3)抑制靶细胞增殖导致病毒裂解细胞膜能力的减弱主要结果:本部分研究了低血清浓度(1%)培养对Jurkat细胞增殖能力的影响,发现1%血清浓度培养72 h后,相对于10%血清浓度培养细胞,细胞数目仅为1/3左右(t=32.233,P=0.000);细胞周期阻滞于G0/G1期(t=11.714,P=0.000),G0/G1期细胞比例占到75.8%,较10%血清浓度上升20%;却未导致细胞凋亡比例上升(t=2.474,P=0.069),仅为3.2%。说明1%血清浓度培养是改变靶细胞增殖状态的一种合适方法。为了探讨细胞增殖状态与病毒感染效率之间的关系,我们将Jurkat细胞经1%、10%血清浓度培养72 h后,再观察Ad5F35L对其感染效率,发现细胞增殖受到抑制的1%血清浓度组,其感染效率显著减低(t=34.314,P=0.000),仅为10%血清浓度组的1/5,表明细胞增殖与病毒感染效率负相关,细胞增殖受到抑制后,病毒对其感染效率也降低。根据本文实验结果表明,Jurkat细胞增殖被抑制后,导致Ad5F35L感染细胞效率的降低,主要有两个方面的原因:1)抑制了 Ad5F35L裂解Jurkat细胞胞内体膜的能力。在pH值为5.0时,Ad5F35L诱导正常培养细胞发生膜裂解比例为13%;而细胞增殖受到抑制的1%血清组,Ad5F35L诱导其细胞膜裂解比例出现降低(t=13.947,P=0.000),仅为4.2%,推测Ad5F35L对胞内体膜的裂解能力也随之降低,导致进入细胞质的病毒数量减少,到达细胞核的病毒数也随之减少,从而导致感染效率降低。2)细胞增殖被抑制后,经胞吞进入细胞的病毒数也随之减少。低血清浓度1%条件下,进入细胞内的病毒数为10%浓度时的75.5%左右(t=5.143,P=0.002)。结论:目前国内外构建的嵌合型腺病毒Ad5F35,其纤毛均使用Ad35的纤毛杆,即Ad5F35S。为了研究纤毛杆对嵌合型腺病毒Ad5F35感染T淋巴细胞效率的影响,该论文成功构建一种新型嵌合型腺病毒Ad5F35L,其纤毛使用Ad5的纤毛杆。该论文利用Ad5F35L感染T淋巴细胞,并取得以下发现:1)Ad5F35L感染T细胞的效率较Ad5大幅提高;在高感染复数时,Ad5F35L对CD8+T/CD4+T细胞及刺激活化后CD8+T/CD4+T细胞的感染效率均高于Ad5F35S,并且Ad5F35L表现低细胞毒性;2)病毒诱导膜裂解能力的差异、逆向运输至胞外病毒数的差异是导致Ad5F35L、Ad5F35S感染效率差异的可能原因;3)靶细胞增殖状态的差异能够影响Ad5F35L感染T细胞的效率,其可能通过两个方面发挥作用:影响细胞膜的流动性而影响病毒经胞吞进入细胞;影响Ad5F35L进入细胞后衣壳蛋白的脱落而改变病毒诱导膜裂解的能力;综上所述,为了研究纤毛杆对嵌合型腺病毒Ad5F35感染T淋巴细胞效率的影响,本研究构建了一种新型嵌合型腺病毒Ad5F35L,其在高MOI值情况下具有比Ad5F35S更高的感染效率,感染T细胞具有较低细胞毒性;同时本文对该现象的机制进行了初步研究,为研究嵌合型腺病毒Ad5F35感染T细胞的机制研究奠定了基础,也为临床上高效、低毒的病毒载体研发提供借鉴。