亚低温对脑复苏大鼠神经细胞凋亡和线粒体损伤的影响

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背景这些年来,随着临床急救水平的不断提升,逐渐提升了窒息、休克、心肺复苏、心肌梗塞等疾病危重患者的生存率,这些疾病会导致患者出现去哪些缺血损伤以及缺血之后再灌注损伤,影响到大脑的复苏情况。怎样在脑复苏后减少神经元死亡和线粒体损伤情况的发生率,本次探究亚低温通过冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein,CIRP)介导的抗凋亡信号转导通路对心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation,CPR)大鼠脑神经细胞凋亡和线粒体的影响,希望可以为今后的临床实际应用提供更可靠的实验依据。方法(1)分组方法。第一,将45只大鼠分为假手术组、常温组和亚低温组(每组15只)。通过模拟窒息后心脏骤停,模拟CPR模型。假手术组将双侧颈动脉分离并且充分暴露出来,采取开颅措施,将基底动脉第二无血管区暴露出来。常温组大鼠建模后的食道内温度和肛温维持在(37.0±0.5)℃,手术组和常温组都置于室温下,亚低温组大鼠在建模后使食道内温度维持在(33.0±1.0)℃。6 h后收集尾静脉血样本和脑组织。检测和比较各组炎性水平、脑组织损伤、神经元凋亡、线粒体形态、线粒体损伤标志蛋白和CIRP的表达量。第二,另外,把亚低温组细分为1h到24h组,4h到24h组和8h到24h组,对比亚低温不同起始时间对于结果的影响。第三,μ-Calpain对神经元存活影响样本情况。选择雄性Long Evans成年大鼠,体重在370g到420g之间。(2)流式细胞分析仪检测结果。首先,在120目不锈钢网上放置固定或者新鲜的组织,使用眼科的剪刀剪碎组织,再使用眼科镊子对组织块进行轻轻捏搓,搓的同时使用生理盐水清洗,一直到把组织搓完为止。使用300目通网将平皿中的混悬液过滤,将细胞团块过滤掉,收集细胞悬液。其次,细胞DNA染色,内参标准为:选取1×10~50.1ml单细胞悬液,加入浓度为10%的苏木精-伊红染色,和样品进行同步染色,再加入1ml碘化丙啶,在温度为4℃的冰箱当中保存半小时,再使用500目铜网过滤。然后,免疫荧光标记细胞。选择1×10~60.1ml单细胞悬液,加入0.1ml鼠抗人单克隆抗体工作液,在室温环境下孵育30分钟,再将10ml PPS加入其中进行洗涤,将上清液舍弃,经过500目铜网过滤之后进行检测。最后,免疫荧光数据分析,引入美国公司生产的EPi CS-XL2型流式细胞仪检测。结果第一,(1)亚低温治疗对于不同组别大鼠生存率的影响结果,假手术组3只生存,生存率为20.0%;常温组有5只生存,占比为33.3%;亚低温组有8只生存,占比有53.3%。可以发现亚低温组大鼠的整体生存率要明显高于另外两组。起始时间为1h的生存率为80.0%;起始时间4h的存活率为60.0%,起始时间8h的为20.0%。其中起始时间8h的生存率还低于常温组。三组大鼠的神经功能良好率差异明显。起始时间在1h、4h和8h的大鼠,生存率之间并无明显差异。(2)3组影像学特点。假手术组神经元分布均匀,细胞核结构清晰。常温组的细胞核染色变深,并且出现间质性水肿。亚低温组的神经元损伤和水肿情况较常温组轻。(3)3组大鼠炎性因子水平、脑组织中线粒体损伤和凋亡标志蛋白达量以及CIRP m RNA和蛋白表达量比较有显著差异(P<0.05)。常温组脑组织损伤程度、凋亡指数、IL-1β、IL-6、线粒体损伤程度、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达量显著高于假手术组(P<0.05)。亚低温组脑组织损伤程度、凋亡指数(16.17±1.82 vs 38.29±3.79)、IL-1β[(39.71±5.09)pg/ml vs(74.24±8.25)pg/ml]、IL-6[(52.47±7.30)pg/ml vs(88.36±10.12)pg/ml]、Cyt C(0.32±0.03 vs 0.87±0.08)、Caspase-9(0.51±0.05 vs 0.92±0.09)、Caspase-3(0.46±0.05 vs 1.05±0.10)显著低于常温组(P<0.05),CIRP m RNA(1.58±0.14 vs 0.30±0.04)和CIRP蛋白(0.87±0.08 vs 0.12±0.01)表达量显著高于常温组(P<0.05)。(4)假手术组的SOD活性值最高,为(67.21±10.06)U/mg prot,其次是常温组,为(55.34±1.06)U/mg prot,最后是亚低温组,为(50.72±1.66)U/mg prot;常温组组织含水量最高,为(86.31±2.15)%,其次是亚低温组(81.42±2.09)%,最后是假手术组,为(78.11±1.02)%;MDA含量最高是假手术组,(4.18±0.11)U/mg prot;其次是常温组,为(0.89±0.31)U/mg prot,最后是亚低温组,为(0.43±0.05)U/mg prot。三组患者的SOD值、组织含水量以及MDA含量差异均显著,具有统计学意义(P<0.05)。第二,capn1sh RNA对于calpain裂解起到了一定的阻碍作用,让神经元得到了有效的保护,经过capn1处理之后的CA1区,神经元处于正常情况的占比更多,而经过capn2处理的CA1区域中正常神经元数量很明显更少。结论亚低温可能通过调控CIRP的表达缓解线粒体损伤,抑制脑神经元凋亡,保护CPR后脑组织损伤。
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