背景非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的,以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征,包括单纯性脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化和肝硬化。各种原因使肝内脂肪堆积超过5%或肝活检中发现单位肝细胞有1／3以上有脂肪滴被称为脂肪肝。在脂肪肝中,非酒精性脂肪肝占80%。NAFLD发病率在不同国家也各有不同,其发病率在不同国家也各有不同,目前西方国家约为20-30%,亚太地区约为12%～24%；儿童发病率约2.6%,肥胖儿童可达52.8%。随着我国经济条件的改善,人民生活水平不断提高,饮食结构、工作的环境及方式的改变,NAFLD发病率明显增加,而且有年轻化趋势。资料显示在我国上海市和广东省NAFLD患病率分别已达到15.4%、11.7%。有资料显示在排除其他肝病后,NAFLD通常是无症状转氨酶升高的最主要原因,约占90%。单纯性脂肪肝(NAFL)有12-40%患者在8-13年内进展为NASH,后可发展为肝硬化,与其他肝病引起的肝硬化患肝癌危险性无明显差异。此外,还与肥胖、2型糖尿病、高动脉压症、高脂血症等代谢综合征密切相关。NAFLD已经成为病毒性肝炎之后第二大慢性肝病,实行肝移植的第三大适应症。NAFLD的总死亡率比普通人显著增高。防治本病已成为全球普遍关注的医学和社会问题。NAFLD病机不甚明了,大多数学者较为认可的有“二次打击”学说,“初次打击”主要为胰岛素抵抗,各种病因所致NAFLD几乎普遍存在胰岛素抵抗现象。胰岛素抵抗通过促使外周脂解增加和高胰岛素血症引起肝细胞脂肪储积,并诱致对内外性损害因子敏感性增高；二次打击主要为反应性氧化代谢产物增多,导致脂质过氧化及其异常细胞因子的作用,进而引起坏死、甚至进展性肝纤维化。最近研究显示,调节肝细胞调节脂质代谢平衡的主要是核转录因子PPAR-α和SREBP-1c,分别促进脂肪的氧化和合成,其信号途径与两次次打击各个环节均有密切的联系,关于其调控的机制成为众医家研究的热点。目前世界范围内尚无疗效确切,安全稳定的治疗NAFLD的药物,研发通过化学合成或从中草药中寻找干预PPAR-α和SREBP-1c信号途径,降低脂质合成,达到治疗目的药物成为热点。非酒精性脂肪肝属中医“肥胖”“胁痛”“黄疸”等病范畴。多由过食肥甘厚味,湿热蕴藉中焦,湿热阻滞,气机受阻,气血运行不畅,而瘀血内生。病理关键在“湿(痰)”“热”“瘀”。虎杖功能清热、利湿、破瘀,作用于NAFLD关键病理因素,自古为中医家治疗“肥胖”“胁痛”“黄疸”等病的要药,虎杖苷为中药虎杖的主要活性成分之一,资料显示在降脂、保护肝细胞等方面有一定效果,本实验旨在用现代分子生物学手段系统观察其疗效,并深入探讨其可能的作用靶点,为临床更确切广泛使用虎杖提供科学依据,为从中草药中开发治疗NAFLD药物作探索性研究。目的1观察虎杖苷对非酒精性脂肪肝早期大鼠的影响,包括在体重、肝重、肝细胞脂肪变、肝功能、血脂代谢的影响。2、研究虎杖苷治疗非酒精性脂肪肝的可能作用机制,包括氧化应激、胰岛素抵抗、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及过氧化物酶体增殖激活物受体-α(PPAR-a),固醇调节元件结合蛋白-1c (SREBP-1c)、肝X受体-α(LXR-α)、蛋白及基因表达的影响。方法：雄性SPF级SD大鼠44只,体重200±10g,正常喂养1周后,完全随机法分为2组,正常组对照(A,8只)和模型组(M,36只),组间大鼠体重差异无显著性(P>0.05)。正常组给予标准饲料,模型组给予高脂饲料(88%标准饲料+10%猪油+2%胆固醇)喂养,自由饮水和进食,动物房保持安静,自然采光,温度25℃左右,喂养持续8周,分别从正常对照组和空白模型组随机挑选一只,取肝脏做病理切片,证实非酒精性脂肪肝形成。再将模型组完全随机法分为5组：空白模型组(B)、虎杖苷高剂量组(C1)、虎杖苷中剂量组(C2)、虎杖苷低剂量组(C3)、非诺贝特组(D),每组7只。8周后,A组、B组予以生理盐水灌胃,1ml/100kg.d, C1、C2、C3分别以160mg/kg.d、80mg/kg.d、40mg/kg.d虎杖苷混悬液灌胃,D组以100mg/kg.d非诺贝特混悬液灌胃。持续4周。第12周末取大鼠血清及肝组织样本,称体重,肝湿重,计算肝指数,全自动生化仪测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C),游离脂肪酸(FFA)；酶法测定空腹血糖(FBG)；放免法检测血清空腹胰岛素(FIN),计算胰岛素抵抗指数(IRI),胰岛素敏感指数(ISI)；对肝组织进行病理学检查,HE染色观察其脂肪变程度；酶联免疫法(ELISA)检测血清肿瘤坏死因子α(TNF-α);蛋白免疫印迹法(western blotting)检测PPAR-α、LXR-α、SREBP-1c蛋白表达；实时荧光定量(real-time PCR)检测PPAR-α、LXR-α、SREBP-1c基因表达。计量资料结果以x±s表示,两组间比较采用t-test。多组间比较采用One way ANOVA,首先对数据进行方差齐性检验,方差齐则用LSD法进间两两比较,如果数据方差不齐,则采用Welch法进行方差分析,应用Dunnett T3法进行两两比较。等级资料资料采用Kruskal-Wallis H非参数检验进行分析,P<0.05为有显著性差异。所有数据采用SPSS 13.0软件包进行统计分析。结果第一部分：虎杖苷对非酒精性脂肪肝药效研究1.根据肝脏病理状态,可见弥漫性肝细胞大泡样脂肪变,无明显炎症、坏死及纤维化,NAFLD大鼠早期单纯性脂肪肝阶段模型复制成功。2.与空白模型组相比,虎杖苷高剂量组体重明显减低(P<0.01),增长速度较慢,肝脏体减小,肝湿重减轻,肝指数明显降低(P<0.01)。肝脏病理显示,虎杖苷高、中剂量组大鼠肝细胞脂肪沉积明显减少(P<0.01),肝细胞形态、排列均明显好转。3.与空白模型组相比,虎杖苷高、中剂量组大鼠血清ALT明显降低(P<0.01,P<0.05),虎杖苷高剂量组明显优于非诺贝特组(P<0.05)；虎杖苷高、中剂量组大鼠血清TG降低(P<0.01, P<0.05);虎杖苷高剂量组大鼠血清TC、LDL-C降低(P<0.05, P<0.01), HDL-C升高(P<0.01)。虎杖苷各剂量组均能降低FFA(P<0.01)。第二部分：虎杖苷治疗NAFLD部分机制研究1.与正常对照组比较,空白模型组大鼠总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽-S转移酶(GST)明显减低(P<0.01),与空白模型组比较,虎杖苷高、中剂量组均能增高肝组织T-AOC、SOD、GST,同时降低肝组织MDA(P<0.01),其中虎杖苷高剂量组提高肝脏抗氧化能力效果均优于非诺贝特组(P<0.01)。2.与正常对照组比较,空白模型组大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FIN)明显增高(P<0.01),IRI增高,ISI明显降低(P<0.01, P<0.05)。与空白模型组比较,虎杖苷高、中剂量组及非诺贝特组能降低FBG、FIN(P<0.01, P<0.05),减低胰岛素抵抗指数(IRI),增高胰岛素敏感指数(ISI) (P<0.01, P<0.05),其中虎杖苷高剂量效果均明显优于优于非诺贝特组(P<0.01, P<0.05)。虎杖苷低剂量各指标与空白模型组无差异(P>0.05)。虎杖苷高、中剂量组在降低IRI,增加ISI效果优于虎杖苷低剂量组(P<0.01)。3.与正常对照组比较,空白模型组大鼠血清TNF-α明显高于(P<0.01),与空白模型组相比,虎杖苷高、中剂量组及非诺贝特组均能明显降低血清TNF-α含量(P<0.01),虎杖苷高剂量组效果明显优于虎杖苷中、低剂量组(P<0.01, P<0.01)。但与非诺贝特组无显著差异(P>0.05)。虎杖苷低剂量组与不能显著降低血清TNF-α含量,与空白模型组无显著差异(P>0.05)。4.与正常组比较,空白模型组大鼠PPAR-α蛋白及基因表达明显降低(P<0.01),SREBP-1c、LXR-α蛋白及基因表达升高(P<0.01),与空白模型组比较,虎杖苷高、中剂量组均能明显降低大鼠肝脏SREBP-1c、LXR-α蛋白及基因表达,明显优于非诺贝特组(P<0.01)；虎杖苷各组PPAR-α蛋白及基因表达与空白模型组无显著差异(P>0.05),非诺贝特能显著增加PPAR-α蛋白及基因表达,与空白模型组及虎杖苷各剂量组存在显著差异(P<0.01)。结论1.虎杖苷能减轻NAFLD大鼠体重,减轻肝脏肿大及肝脏湿重。显示虎杖苷有一定的减肥作用,通过减轻内脏脂肪堆积达到治疗NAFLD。2.虎杖苷能减少血清FFA,降低血清TG、TC、LDL-C,增加HDL-C,纠正血脂紊乱。同时虎杖苷能减少NAFLD单纯性脂肪肝阶段肝细胞脂质沉积,从而减轻脂肪对肝细胞造成的水肿、缺氧以及炎症。可能机制是通过减少进入肝细胞游离脂肪酸,从而降低肝脏甘油三酯合成,减轻过量FFA的毒性作用,逆转肝脏脂肪沉积,改善肝功能,保护肝细胞。3.虎杖苷能增强体内抗氧化能力,减少脂质过氧化,减轻肝脏炎症及脂肪肝进展。虎杖苷可通过减少循环中血清FFA,减少肝细胞FFA的摄入,从而减轻线粒体氧化负荷,改善线粒体β氧化,减少活性氧及自由基的产生。4.虎杖苷降低循环中TNF-α的含量,改善胰岛素抵抗,减少脂肪组织分解及循环中FFA的释放,减轻肝细胞脂质沉积。5.虎杖苷能下调脂质合成因子SREBP-1c、LXR-α蛋白及基因的表达,减少脂质合成。