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知母为百合科植物知母（Anemarrhena Bge.）的干燥根茎,用于清热泻火,滋阴润燥等作用,收载于2015版《中国药典》。课题组前期实验发现知母皂苷组分具有很好的抗炎、利尿、免疫调节等作用。皂苷组分是“苦味”的物质基础,“解热和通便”作用是其“苦味”的功效的体现。传统的植物化学方法已经从知母中分离出许多皂苷类成分,但对于微量的新型植物皂苷,由于其结构多变,水溶性强,对其分离纯化仍是一个难点重点,本论文建立知母皂苷UPLC-MS分析方案,为传统植物化学研究指明方向,有助于发现和预测知母中微量且药理活性强的甾体皂苷,以及为研究、开发有效安全可靠的知母新药提供科学依据。本论文包括以下内容:1.对知母甾体皂苷苦味物质基础进行了系统的综述研究本文主要针对知母中皂苷类成分及其药理活性研究进行了归纳和梳理,共总结59种知母皂苷,包括25种甾体皂苷元,33种呋甾烷醇型知母皂苷,26种螺甾烷醇型知母皂苷,为知母甾体皂苷的质谱裂解规律研究提供了坚实的文献基础。2.总结了甾体皂苷类标准品的质谱裂解规律采用超高效液相色谱-三重四级杆线性离子阱（UPLC-Qtrap）液相质谱联用技术,正离子模式下,对知母相关标准品进行色谱和质谱参数的优化,通过比较标准品的保留时间,我们可以得出呋甾烷醇型甾体皂苷的保留时间均小于螺甾烷醇型甾体皂苷的保留时间,这可能是由于羟基个数相同时,大多数呋甾烷醇皂苷元的极性大于螺甾烷醇甾体皂苷元的极性。2.1呋甾烷醇型知母皂苷质谱裂解规律2.1.1对于双糖链C22-OH/OMe型呋甾烷醇皂苷来说,其C22为一个含氧季碳,连在其上的OH或OMe易断裂,在CE=8 eV的能量状态下,一般不会出现[M+H]+的离子峰,而会出现[M-H2O+H]+或[M-CH3OH+H]+的离子峰,此时,能够观察到[M+NH4]+中性损失35 Da和49 Da碎片离子峰;之后在CE=15 eV的能量状态下,以其为母离子进行裂解,能够观察到依次失去各单糖基后形成[Agly.-H2O+H]+或[Agly.-CH3OH+H]+的信号离子峰;在CE=35 eV的能量状态下,苷元中E环裂解,产生两条特征性裂解途径分别为:[S1+H]+→[S1-C8H16O2+H]+→[S1-H2O-C8H16O2+H]+（Δm=144和18 Da）和[S1+H]+→[S1-H2O+H]+→[S1-H2O-C8H16O2+H]+（Δm=18和144 Da）。2.1.2对于双糖链Δ20（22）-型呋甾烷醇皂苷来说,由于其C22位没有含氧基团取代,在CE=8 eV的能量状态下,仅能观察到[M+NH4]+和[M+H]+的离子峰（中性损失17 Da）;在CE=15 eV的能量状态下,能观察到[M+H]+依次失去各单糖基后形成苷元的信号离子峰;在CE=35 eV的能量状态下,能产生与 2.1.1 中相同的苷元裂解途径分别为:[S1+H]+→[S1-C8H16O2+H]+→[S1-H2O-C8H1602+H]+（Δm=144和18 Da）和[S1+H]+→[S1-H2O+H]+→[S1-H2O-C8H1602+H]+（Am=18 和 144 Da）。2.1.3对于单糖链C22-OH/OMe型呋甾烷醇皂苷来说,在CE=8 eV的能量状态下,能观察到[M+NH4]+和[M-H2O+H]+的离子峰（中性损失35 Da）;在CE=15 eV的能量状态下,[M-H2O+H]+继续裂解,能够观察到其依次失去各单糖基后形成[Agly.-H2O+H]+的信号离子峰。在CE=35 eV的能量状态下,苷元的裂解途径分别为[S2+H]+→[S2-H2O+H]+→[S2-H2O-C8H160+H]+（Am=18和128 Da）和[S2+H]+→[S2-C8H160+H]+→[S2-C8H16O-H2O+H]+（Δm=128 和 18 Da）。2.1.4对于双糖链C20-OH型呋甾烷醇皂苷来说,其具有一个特殊的OH连接在C-20位。在CE=8 eV的能量状态下失去C-20羟基,形成Δ20-,其与Δ22-形成双双键共轭体系,能够观察到[M+NH4]+和[M-H2O+H]+的离子峰（中性损失35 Da）;在CE=15 eV的能量状态下,以[M-H2O+H]+为母离子裂解,能够观察到依次失去各单糖基后形成[Agly.-H2O+H]+的信号离子峰;在CE=35 eV的能量状态下,苷元的特征裂解途径分别为[S3+H]+→[S3-C8H14O2+H]+→[S3-C8H14O2-H2O+H]+（Δm=142和18Da）和[S3+H]+→[S3-H2O+H]+→[S3-H2O-C8H14O2+H]+（Δm=18和142 Da）。2.2螺甾烷醇型知母皂苷质谱裂解规律CE=8 eV的能量状态下,螺甾烷醇型皂苷能够观察到[M+NH4]+和[M+H]+的分子离子峰（中性损失1 7 Da）;CE=15 eV的能量状态下,能观察到[M+H]+依次失去各单糖基后形成[Agly.+H]+的信号离子峰;CE=35 eV的能量状态下,苷元的两条特征裂解路径分别为:[S4+H]+→[S4-C8H16O2+H]+→[S4-C8H16O2-H2O+H]+（Δm=144 和 18 Da）和[S4+H]+→[S4-H2O+H]+→[S4-H2O-C8H1602+H]+（Δm=18 和 144 Da）。3.建立了知母皂苷质谱鉴定策略本文首次使用MIM-IDA-EPI作为非靶向扫描模式研究知母中皂苷类成分,结合文献综述建立数据库,构建了知母甾体皂苷质谱研究策略。在CE=8 eV的ESI+-EPI谱中,对于中性损失35 Da（[M-H2O+H]+）或49 Da（[M-CH3OH+H]+）的这类甾体皂苷,其分子结构为C-22连有OH或OMe的呋甾烷醇型甾体皂苷;对于中性损失17 Da的这类甾体皂苷,其皂苷结构有两种可能,第一种是Δ20（22）-呋甾烷醇型甾体皂苷,第二种是螺甾烷醇型甾体皂苷。结合化合物的色谱行为,可以进一步推测其为螺甾烷醇型甾体皂苷还是Δ20（22）-呋甾烷醇型甾体皂苷。在CE=15 eV的ESI+-EPI谱中,均能够明显的观察到知母皂苷连续失去各单糖基（162 Da,Glc,Gal,Man;146 Da,Rha,Fuc 和 132 Da,Xy1,Ara）的离子峰。根据其连续失去糖信号峰,可以推测该甾体皂苷糖链中含糖的数量及各单糖的种类和连接顺序。然而,在CE=35 eV的ESI+-EPI谱中,可以观察到知母皂苷元失去C22-OH/OMe形成Δ20（22）-furostanol基本骨架的特征离子,既而其开环和失去水分子产生一系列特征的碎片离子。对于呋甾烷醇型甾体皂苷元来说,中性损失144 Da从Δ20（22）-furostanol基本骨架,可推测其为基本的C26-hydoxxy-Δ20（22）-furostanol型结构;对于中性损失128 Da从Δ20（22）-furostanol基本骨架,可推测其侧链中C26无OH取代,即为Δ20（22）-furostanol型结构。与基本结构相比,中性损失142Da从以上基本骨架,可推测其为C26-hydroxy-Δ20（22）-Δ25（27）-furostanol 型结构;中性损失 126 Da 可推测其侧链C26 无 OH 取代,即为 Δ20（22）-Δ25（27）-furostanol 型结构。对于螺甾烷醇型甾体皂苷来说,苷元开环和失去水分子产生一系列特征的碎片离子,苷元中性损失144 Da可推测其为spirostanol基本骨架;苷元中性损失160 Da可推测其为C23-hydoxy-spirostanol型结构。与基本结构相比,苷元的中性损失142 Da可推测其为Δ25（27）-spirostanol型结构;苷元中性损失158 Da可推测其为C23-hydroxy-Δ25（27）-spirostanol型结构。最后,用 MRM实验确证前面结果的准确性。MRM中选用[M+NH4]+（Q1）/[Agly.-H2O+H]+（Q3）作为MRM实验的离子对,这样不仅可以排除同位素干扰,还可以提高灵敏度,同时排除离子源内裂解产生的的碎片离子。4.运用RP-UPLC-MS/MS技术对知母苦味物质基础的研究运用RPLC-MS/MS技术和前文建立的质谱研究策略,第三章分别阐述了详细的鉴定过程,最终,87个皂苷包括55个呋甾烷醇型知母皂苷和32个螺甾烷醇型知母皂苷被检测出来,其中 19个甾体皂苷首次在知母中发现,13个甾体皂苷为潜在的新化合物,8个新颖的皂苷元在知母中发现。本文在阐明知母皂苷组分的性味物质基础,发现预测新颖的甾体皂苷类成分等方面具有重要的学术价值,同时为今后相关药理学研究提供了重要的科学依据。5.运用HILIC-UPLC-MS/MS技术对知母苦味物质基础的研究运用HILIC-UPLC-MS/MS技术,通过对1 1个相关标准品的研究,总结了亲水作用色谱的洗脱行为和质谱裂解规律,最终,检测并鉴定了35个知母甾体皂苷包括8个螺甾烷醇型知母皂苷和27个呋甾烷醇型知母皂苷,其中峰94暂时鉴定为潜在的新化合物,峰88和93为首次在知母中发现,峰89、90、91、92、95和96为在反向色谱中未被检出的知母皂苷。运用亲水作用色谱技术,不仅扩大了对知母苦味物质基础的研究范围,同时为今后植物化学分离微量新颖的皂苷成分奠定了基础。