研究目的:研究表明,下丘脑炎症和肥胖之间有密切关系,抑制下丘脑炎症有助于抵抗肥胖的发生与发展。课题组前期研究发现n-3多不饱和脂肪酸（n-3polyunsaturated fatty acids,n-3 PUFAs）具有抑制下丘脑炎症及抵抗肥胖的作用,但是其具体机理尚不明确。外泌体miRNA对疾病的发生发展具有重要作用,因此我们猜想可能是n-3PUFAs的增加对小鼠下丘脑神经干细胞来源的外泌体miRNAs表达产生了影响,故我们选择对下丘脑神经干细胞来源的外泌体miRNAs及其靶基因进行分析,进而探究n-3PUFAs抑制下丘脑炎症及肥胖的作用机制。研究方法:分别取新生的可以自发生成n-3PUFAs的fat-1转基因小鼠和同窝野生型小鼠的下丘脑神经干细胞进行原代培养,超速差速离心法从细胞上清中收集外泌体。依据国际上通用的研究外泌体的鉴定方法对样本进行鉴定检测,确定样本是否为外泌体,透射电镜（Transmission Electron Microscope,TEM）检查样本中有无经典的外泌体结构;纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）技术检测样本中的纳米颗粒总体粒径分布情况;Western Blotting实验检测样本中外泌体标志蛋白CD63的表达情况。提取下丘脑神经干细胞来源的外泌体中的总RNA,构建文库,进行miRNA高通量测序。测序后,利用生物信息学技术对高通量测序结果进行分析,筛选显著差异表达miRNA,制作差异表达miRNA聚类热图、散点图、火山图。选择差异程度较大的差异表达miRNA,在miRNA靶基因数据库Target Scan、miRDB和mi Tar Base中进行靶基因预测。根据差异表达miRNA靶基因预测的结果,在GO（Gene Ontology）数据库、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库进行靶基因功能富集分析,查找与下丘脑炎症及脂肪酸代谢相关的信号通路,选择具有代表性且相关性强的差异表达miRNA。根据相关miRNA的靶基因预测结果,且进行q PCR验证,分析内源性n-3PUFAs的增加对于下丘脑神经干细胞来源的外泌体miRNA的影响,以及这些差异表达的miRNA对下游靶基因的调节作用,探究n-3PUFAs与下丘脑炎症或其他机能方面的关系。研究结果:成功培养了下丘脑神经干细胞,并经过形态学及标志蛋白的WB鉴定。外泌体提取成功,经透射电镜（TEM）检测发现典型的双层囊泡状外泌体结构;经纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术检测发现样本颗粒粒径集中分布在120nm左右,且占比超过97.5%,符合外泌体粒径表征;通过Western Blotting实验发现,样本中有外泌体表面标志蛋白CD63表达。成功提取外泌体样本中的总RNA,且RNA样本符合测序建库要求,可用于下一步高通量测序。对miRNA高通量测序结果进行定量分析,结果显示,与野生型C57BL/6小鼠下丘脑神经干细胞外泌体miRNA相比,fat-1转基因小鼠组差异表达显著（P<0.05且FC值≥1.5）的miRNA共有105个,其中显著上调的有65个,显著下调的有40个;利用生物信息学技术对差异表达显著的miRNA进行深度筛选发现,其中8个处在下丘脑炎症通路、脂肪酸代谢通路中的关键位置。经深度筛选发现的8条重要差异表达miRNA分别为miR-122-3p、miR-694-5p、miR-17-92基因簇、miR-3683b-3p、miR-493-5p、miR-300-5p、miR-217-5p、miR-31-3p。对以上miRNA的靶基因进行分析,发现14个重要的基因,这些基因的功能与炎症因子表达、脂肪酸代谢等活动密切相关,所对应的靶基因分别为STAT3、IL-1α、IL-6、TLR-4、Elovl2、Elovl5、Srebf1、Scd1、Acot13、Ffar1、Ffar2、Fads3、ACSL3、Hsd17b4。经荧光定量PCR检测,以上基因均被上调或者下调,说明这些基因受到了调控。研究结论:内源性n-3PUFAs的增加可以调节下丘脑神经干细胞外泌体中miRNA的表达,其中具有显著差异性的miRNA与下丘脑炎症及脂肪酸代谢相关,且其靶基因处在相关通路的关键位置,提示内源性n-3PUFAs可以通过调节下丘脑神经干细胞外泌体中miRNA的表达,进而调控炎症反应与脂质代谢相关基因的表达,从而发挥抑制下丘脑炎症、抵抗肥胖的作用。