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随着世界经济的快速发展,当前社会迫切需要找到可持续的能源作为化石燃料的替代品。由于氢气(H2)在完全燃烧后无二氧化碳(CO2)释放,燃烧热值高,被认为是最具吸引力的清洁替代能源。对比传统工业上化石燃料转化的制氢方法,基于太阳能转化的生物产氢由于其环境友好性受到越来越多的关注。在已知的产氢有机体中,绿藻由于其清晰的遗传背景、廉价的培养成本、高效的氢酶活性等优势,被视为目前最有应用前景的生物制氢途径。然而,由于绿藻中催化产氢的关键酶系——氢酶的活性受到光合作用伴生的氧分子抑制作用,在自然条件下绿藻产氢仅能持续数秒到数分钟。如何让绿藻细胞持续性光合产氢成为长期以来制约绿藻光合产氢技术发展的理论瓶颈问题。研究者在前期工作中发现,缺硫培养后的莱茵衣藻光系统II核心蛋白D1的合成受到抑制,光系统II活性显著下降,致使衣藻细胞光合放氧发生可逆下降从而达到衣藻胞内厌氧的状态,实现衣藻持续性的光合产氢。在此基础上,本研究进一步提出通过基因工程的手段调控光系统II相关基因,在不需缺硫胁迫、不需变换培养条件的前提下,利用人工mi RNA(ami RNA)技术靶向光系统II相关基因,从而实现衣藻细胞持续性光合产氢。具体结果如下:1.以光系统II核心蛋白——D1蛋白的编码基因为靶点,运用WMD3在线平台成功设计出靶向该基因的ami RNA序列;2.成功构建了ami RNA-D1的表达载体,该载体利用莱茵衣藻内源性Cre-MIR1162作为表达骨架,由热激启动子控制表达,通过“珠磨法”对莱茵衣藻进行遗传转化;3.热激处理后,转化株中ami RNA-D1的表达量对比热激处理前提高了15倍,表明在衣藻细胞中ami RNA-D1被成功诱导表达;4.热激处理后,转化株中ami RNA靶基因的表达量下降了73%,显示了ami RNA对靶基因的显著下调作用;5.通过Phyto-PAM技术检测反映PS II活性的Yield值,热激处理后,转化株Yield值下降53%;6.检测连续两次热激处理后野生株与转化株的产氢量与耗氧量,转化株的产氢量与耗氧量对比野生株均有显著提高。在第一次热激处理后,转化株的产氢率达到最大值,为野生株的2.3倍;7.检测一次热激后野生株与转化株连续7天后的产氢量与耗氧量,转化株的产氢量与耗氧量对比野生株均有显著提高,转化株的累积产氢量对比野生株提高了57%。综上所述,本研究成功构建了可在非营养胁迫条件下持续产氢的莱茵衣藻转化株该转化株提供了在正常培养条件下调节衣藻产氢的新策略。