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自20世纪初以来,食蟹猴作为人类的近亲,凭借其体型小、易于管理、经济和繁殖快速等优点越来越受到医学生物学研究者的亲睐。研究者对于食蟹猴基因组结构、功能及进化等方面的研究非常感兴趣。MHC作为人类疾病易感性和发病速度的关键因素,对其结构与功能的探索和研究一直是免疫学研究焦点。但因其在基因重复、插入缺失变异、序列多样性、保守性等方面非常的复杂,也使得食蟹猴MHC区全序列获取成为难点。本文以Fosmid质粒为载体,构建食蟹猴MHC基因组Fosmid文库,通过进一步筛选食蟹猴MHC区克隆重叠群尝试对食蟹猴MHC进行组装。主要研究结果如下:(1)以编号为100107的食蟹猴个体新鲜外周血为材料提取其基因组,并以p CC2FOS为载体,构建食蟹猴基因组Fosmid文库。文库包含了770000个克隆,保存在312个pooling里,平均插入片段为40Kb,总计数据30.8Gb。(2)以本课题组之前发表的恒河猴与食蟹猴基因组测序文章中两只猴子的MHC为参考序列,找出298个具有唯一性的位点,选出100bp位点序列,以其为基础分为两部分各50bp加上25bp氨苄设计重组引物,另外在这100bp的上下游设计筛选引物;从312个pooling中随机选择96个pooling进行低深度测序,下单数据为2G,测序深度约2X。将低深度的pooling测序结果比对回重组引物,找出含有重组位点的阳性pooling,再实验测试重组引物,最终获得79对可用重组筛选引物。(3)设计跟目标区域同源的同源重组框,同源重组框共75bp:包含了50bp同源序列和25bp氨苄序列,在与包含长为1130bp的氨苄抗性基因的18T载体PCR后,将氨苄抗性筛选引入到质粒,经平板培养后筛选出具有抗性的含MHC重组片段的阳性克隆。在79对引物中的69个位点得到了135个不重复克隆,覆盖大小约为2.8M,上机测序。(4)测序后组装的contigs显示它们在1058Kb-2200Kb,3175Kb-4300Kb两个区段密集分布,挑选出38个位于1058Kb-2200Kb区域的克隆,大片段文库测序,尝试对该部分进行局部精细组装连接。(5)对大小片段测序的contigs进行基因注释,总共注释出89个不重复基因,其中非经典MHC I类基因19个,MHC III类基因14个,比对到人上的基因56个。