血吸虫病是全球重要的公共卫生问题,由血吸虫感染引起,全球约有2.3亿人感染血吸虫,其中日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫对人类危害较大。不同种的血吸虫有其特定的中间宿主,双脐螺是曼氏血吸虫的中间宿主,研究显示,中间宿主螺的分布与血吸虫病的分布区域高度重合,世界卫生组织（WHO）认为控制和消灭中间宿主是阻断血吸虫病的重要措施。目前,我国南方部分省份已经发现藁杆双脐螺分布,光滑双脐螺（Biomphalaria glabrata）具有藁杆双脐螺类似的生物学特性,同样有在这些地区定殖的风险。研究控制双脐螺属在我国的扩散和入侵对阻止曼氏血吸虫病在我国的分布和控制外来物种入侵具有重要意义。氯硝柳胺（niclosamide）在上世纪五十年代被发现后一直用于灭螺工作,是世界卫生组织唯一推荐的灭螺药物。氯硝柳胺具有杀螺效果好、对哺乳动物毒性低、环境污染低等优点,同时对螺卵和血吸虫尾蚴亦有较强的杀灭作用,但是氯硝柳胺对鱼、虾等非靶生物毒性较大的缺点,使其应用受到限制。研究氯硝柳胺杀螺机制可以为筛选降低非靶生物毒性的药物、新杀螺药物和杀螺增效剂提供理论依据,为阻止光滑双脐螺在我国定殖提供实验依据。目前氯硝柳胺杀螺机制仍不清楚,代谢组学结果提示,氯硝柳胺对钉螺代谢影响主要集中在糖代谢和能量代谢相关途径,其中糖酵解/糖异生、柠檬酸循环（TCA循环）、磷酸戊糖途径和氧化磷酸化是受影响最为显著的代谢途径。相关转录组学研究结果,也发现氯硝柳胺对糖代谢和氧化磷酸化的影响。对光滑双脐螺相关研究显示,氯硝柳胺影响光滑双脐螺线粒体损伤相关基因的表达。近年来,在旧药新用的热潮中,氯硝柳胺被发现对多种癌细胞存在抑制作用,许多研究都发现氯硝柳胺对细胞能量代谢造成影响,细胞三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）含量降低,活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量上升,提示氯硝柳胺主要作用靶点可能为线粒体,影响机体能量代谢过程。但目前对氯硝柳胺影响螺类能量代谢的研究依然较少,本研究选取光滑双脐螺为研究对象,通过研究氯硝柳胺对光滑双脐螺能量代谢关键环节的影响,为进一步探究氯硝柳胺的作用机制和筛选新杀螺药物提供理论依据。本研究分为以下两个部分:一、氯硝柳胺对光滑双脐螺氧化磷酸化的影响测定实验室条件下氯硝柳胺对光滑双脐螺12 h浸杀半数致死浓度(LC50),在此基础上测定氯硝柳胺分别作用光滑双脐螺4、8、12 h后线粒体电子传递链上各复合物活性及体内ATP含量变化,0 h组为对照组。为明确氯硝柳胺是否直接与电子传递链上各复合物作用,将各复合物提取后与不同浓度氯硝柳胺溶液混合,测定各复合物活性,二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO）组作对照组。采用密度梯度离心法提取光滑双脐螺线粒体,检测提取线粒体总蛋白浓度及纯度,符合条件后用于后续实验。提取的线粒体样本分别加入终浓度0.2、0.4、0.6、0.8、1μg/m L的氯硝柳胺溶液,20μg/m L氰化羰基-3-氯苯腙（carbonyl cyanide3-chlorophenylhydrazone,CCCP）作阳性对照,0.5%DMSO作阴性对照,使用JC-1检测线粒体膜电位,连续检测荧光强度30 min。提取的线粒体样本分别加入终浓度0.2、1μg/m L的氯硝柳胺溶液,0.5%DMSO作阴性对照,分光光度法测定作用10、20、30 min时线粒体膜通透性转运孔开放度。实验室条件下测定12 h浸杀LC50结果为0.106 mg/L。线粒体电子传递链复合物活性及ATP含量测定结果显示,未发现0.106 mg/L氯硝柳胺对复合体Ⅰ活性产生影响;复合体Ⅱ在氯硝柳胺作用后活性先上升后下降,4 h、8 h组相比对照组活性上升（P＜0.05）,12 h相对于8 h组活性下降（P＜0.05）;复合体Ⅲ各组中8、12 h作用组相对于对照组活性下降（P＜0.05）,4 h组相对于对照组差异无统计学意义（P＞0.05）;复合体Ⅳ活性先上升后下降,4 h组相对于对照活性上升（P＜0.05）,8、12 h组相对于4 h组活性下降（P＜0.05）;复合体Ⅴ各组中8、12 h作用组相对于对照组活性下降（P＜0.05）,4 h组相对于对照组差异无统计学意义（P＞0.05）;体内ATP含量,8、12 h组相对于对照组ATP含量下降（P＜0.05）,4 h组相对于对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。提取的光滑双脐螺电子传递链上各复合物与0.2μg/m L和1μg/m L氯硝柳胺溶液作用后,各复合物活性相比于对照组（DMSO组）差异均无统计学意义（P＞0.05）,表明氯硝柳胺可能不直接作用于电子传递链上的复合物。通过梯度密度离心法成功提取光滑双脐螺体外线粒体样本,可以用于后续实验。线粒体膜电位检测结果表明,加入氯硝柳胺后,不同浓度氯硝柳胺均造成光滑双脐螺线粒体膜电位下降（P＜0.05）,作用效果与氯硝柳胺作用浓度和时间呈依赖关系。线粒体膜通透性转运孔开放度测定结果,0.2和1μg/m L氯硝柳胺组作用30分钟内,开放度差异无统计学意义（P＞0.05）。本部分研究表明,氯硝柳胺作用光滑双脐螺后,光滑双脐螺线粒体膜电位降低,电子传递链上复合物活性改变,氧化磷酸化受到抑制,体内ATP含量降低,机体能量代谢受到影响,可能是导致光滑双脐螺死亡的重要原因。二、氯硝柳胺对光滑双脐螺中心碳代谢影响的靶向代谢组学分析中心碳代谢（central carbon metabolism,CCM）包括糖酵解途径、磷酸戊糖途径以及三羧酸循环途径,是生物体所需能量的主要来源。基于此前研究结果,为进一步了解氯硝柳胺对光滑双脐螺能量代谢的影响,本研究共选取了中心碳代谢相关的56种化合物,对氯硝柳胺处理6 h和12 h光滑双脐螺样本进行靶向代谢组学分析,0 h处理组作对照组。基于HPIC-MS/MS分析平台,建立靶向代谢组学的监测分析方法,并通过方法学验证,实验选取56种化合物进行定量分析,实际光滑双脐螺组织样本成功定量检测并鉴定52种目标代谢物具体含量,可以用于后续分析。6h处理组和对照组相比,共获得13种显著差异代谢物（P＜0.05）,上调的9种代谢物分别为α-酮丁酸、α-酮戊二酸、α-酮异戊酸、甘油酸、乳酸、甲基丙二酸、α-酮己二酸、丙酮酸、琥珀酸,下调的4种代谢物分别为磺基丙氨酸、葡萄糖醛酸、马来酸、甲羟戊酸;12 h处理组和对照组相比,共获得11种显著差异代谢物（P＜0.05）,上调的8种代谢物分别为α-酮丁酸、α-酮戊二酸、α-酮异戊酸、2-羟基丙酸、甲基丙二酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、琥珀酸,3种下调的代谢物分别为磺基丙氨酸、葡萄糖醛酸、马来酸。ROC分析结果,除6 h处理组葡萄醛酸曲线下面积（area under curve,AUC）为0.88,其余差异代谢物AUC值均为1,结果可信度极高。本部分研究表明,氯硝柳胺作用光滑双脐螺后,促进了糖酵解途径和TCA循环,导致丙酮酸含量上升,光滑双脐螺以丙酮酸为核心调节相关代谢产物含量以满足机体能量供给需求。综合实验结果,显示氯硝柳胺进入螺体后,主要作用靶点为光滑双脐螺线粒体。氯硝柳胺可能作为一种高效解偶联剂导致光滑双脐螺线粒体膜电位降低,抑制氧化磷酸化,影响ATP合成。光滑双脐螺为满足机体供能需求,线粒体电子传递链上复合体Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ活性上升,糖酵解途径磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的转化加强,无氧呼吸加强,为机体提供ATP。氯硝柳胺还促进了TCA循环,抑制乙酰辅酶A向其它代谢途径转化,导致α-酮戊二酸、琥珀酸的含量上升。随着氯硝柳胺作用时间增加,线粒体电子传递链上复合体Ⅱ、Ⅳ、Ⅲ活性下降,氧化磷酸化抑制增强,其它代谢途径产生的ATP无法弥补缺口,ATP含量降低,机体能量供给不足,可能是导致光滑双脐螺死亡的重要原因。