淫羊藿多糖组分EP80的结构及其对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用研究

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随着经济的不断发展和人际交往关系的扩大,人们对酒的需求量不断增加,酒精性肝损伤(alcohol-induced liver injury,ALI)在人群中的发生率也逐渐增加。因过量摄入酒精而引发的一系列问题严重威胁人类健康,尤其是对肝脏的毒性作用。但目前防治ALI药物较少,而植物多糖作为一种天然植物提取物,可通过改善肝功能、提高抗氧化能力、调节乙醇代谢、减轻炎症反应等多种途径发挥保肝作用。充分开发与利用药食同源植物资源,从中寻找有效的防治酒精性肝损伤的功能因子,开展解酒保肝的作用机理研究,对于抗酒精性(化学性)肝损伤保健食品的研发具有一定的现实意义。淫羊藿是我国具有悠久应用历史的药食同源植物,含有多糖、生物碱、木脂素、黄酮类化合物等多种植物化学成分,归肝、肾经,具有强志、补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效,但使用淫羊藿多糖预防急性酒精性肝损伤的研究较为少见。从淫羊藿中提取的可食性多糖,具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤、降血脂等功效。本研究首先对淫羊藿中的多糖组分进行提纯分级和结构表征,再对其进行活性分析和抗酒精性肝损伤的保肝机制的探究,最后利用蛋白质组学的方法探究淫羊藿多糖防治急性酒精性肝损伤的可能分子机制。主要研究结果如下:1.本研究首先从淫羊藿中制备得到淫羊藿总多糖,而后使用不同体积分数(V/V)的乙醇(80%,60%,40%)进行分级分离,得到三个组分的分级醇沉多糖组分(EP80,EP60,EP40)。由Molish实验、Fehling实验和I2-KI实验确定了各组分淫羊藿多糖为无还原性的非淀粉糖类物质,其紫外光谱扫描(UV)图谱只在200 nm附近有吸收峰,表明样品中无核酸、蛋白质等杂质。薄层色谱显示EP40、EP60是由半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖三种单糖组成,EP80由木糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖四种单糖组成。粘度法测得EP80的粘均分子量为3.2×10~4Da。傅里叶红外光谱(FT-IR)发现多糖样品存在C-O-C以及C-H-O伸缩震动吸收峰,含有吡喃糖苷结构;圆二色谱(CD)发现多糖样品在230 nm和260 nm处分别具有两个吸收峰,表明其存在正Cotton效应和负Cotton效应;扫描电镜(SEM)发现多糖样品的微观形貌呈不规则片状、褶皱结构;热重分析(TG)表明其热失重区间主要在240-350℃;刚果红实验结果显示,多糖样品含有三股螺旋结构。2.通过抗氧化实验发现淫羊藿多糖对DPPH、ABTS自由基具有较好的清除能力,综合总还原力实验发现淫羊藿多糖具有一定的抗氧化活性。其中,EP40对DPPH、ABTS的清除作用最强,EC50值分别为0.006、0.169 mg·m L-1,EP80的总还原力活性高于其他组分。此外,各组分淫羊藿多糖对乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶都具有较好的激活作用,EP80对两种酶的激活率都优于EP40和EP60。通过建立急性酒精性肝损伤小鼠模型,探究了淫羊藿多糖对急性酒精性肝损伤小鼠的保护机制。通过灌胃30 d的淫羊藿多糖,对小鼠生化指标的测定以及肝脏病理组织切片的分析,发现淫羊藿多糖对急性酒精性肝损伤小鼠具有一定的保护作用,其中,600 mg/kg·bw剂量的淫羊藿多糖对小鼠的保护作用最佳,与PC组小鼠各指标相差甚微。实验结果表明淫羊藿多糖能够有效降低遭受酒精暴露后小鼠的肝脏指数,降低血液中ALT、AST、TBIL、TG、TC等相关生化指标的含量,增强小鼠肝脏的抗氧化能力,减少乙醛等中间代谢产物在小鼠肝脏的积累,保护小鼠肝脏免受酒精暴露而引起的血清胆红素代谢异常,同时改善小鼠经过酒精暴露后的氧化应激反应。3.使用Label-free非标定量蛋白质组学技术分析E600组和MC组的小鼠肝脏蛋白表达谱的变化,获得差异表达蛋白(DEPs)信息,以探究淫羊藿多糖对急性酒精性肝损伤小鼠的保护机制。在对比过程中共发现275个DEPs,这些DEPs的表达量发生了显著改变。GO注释分析显示DEPs参与了多种生物过程、细胞组分的构成以及发挥多种分子功能,通过多靶点对进行酒精性肝损伤进行干预。KEGG通路分析显示显著富集的通路包括“细胞凋亡”和“脂肪酸生物合成”,DEPs可能主要是通过影响这些通路来调节小鼠的脂代谢和氧化应激过程。
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