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实验背景和目的:
双酚A(BisphenolA,BPA)作为生产环氧树脂和聚碳酸酯的原材料,广泛应用于电子元件、纸张涂料、染料、医疗器械、餐具和婴儿用品的生产。现在BPA污染十分严重。BPA具有类雌激素样作用,虽然其生物活性大约是雌二醇的万分之一,但是还可以影响内分泌系统和生殖系统,是一种潜在的内分泌干扰物,还可能与男性生殖道的异常发育有关。胎儿睾丸主要含三种重要的细胞:胎儿睾丸间质细胞、胎儿支持细胞和原始精细胞。胎儿睾丸间质细胞是男性睾丸内一种重要的内分泌细胞,对于男性生殖道的正常发育至关重要。胎儿睾丸间质细胞的主要功能是合成雄激素睾酮和胰岛素样因子3;胎儿支持细胞主要分泌抗苗勒管激素。胎儿睾丸间质细胞的发育也受到胎儿睾丸其他细胞(如胎儿支持细胞和精细胞)的影响。目前,宫内暴露于BPA对胎儿睾丸细胞(特别是胎儿睾丸间质细胞和胎儿支持细胞)发育的影响尚不清楚。本实验的目的是研究BPA宫内暴露如何影响胎儿睾丸的发育以及其机制。
实验方法:
将妊娠SD大鼠随机分为4组:对照组(玉米油)、处理组(4mg/kg、40mg/kg和400mg/kg剂量的BPA,其中BPA溶于玉米油中),每组6只。到妊娠第12天,处理组分别灌胃4mg/kg、40mg/kg和400mg/kg剂量的BPA,对照组灌胃等量的玉米油。每天对每只雌性SD孕鼠进行一次称重,同时对动物的活动状态进行观察记录。到妊娠第21天,取雄性仔鼠,称重,记录雌雄比,取仔鼠血清测睾酮,取出睾丸,分离每对睾丸,一侧睾丸用波恩氏固定液(Bouin’s)浸泡,用苏木精-伊红组化染色法(hematoxylin-eosinstaining,HE)测量多核原始生殖细胞数目;用免疫组化染色胎儿睾丸间质细胞进行生物标记(细胞色素P450胆固醇侧链切割酶,CYP11A1和支持细胞标记物SOX9)来进行免疫组织化学分析测量仔鼠睾丸间质细胞数目、细胞大小和细胞群分布,用CYP11A1-增殖标记物和增殖细胞核抗原(PCNA)共染色进行免疫荧光化学分析胎鼠睾丸间质细胞增殖情况。对侧睾丸冷冻来提取RNA,用实时荧光定量核酸扩增检测(qPCR)实时定量测量胎儿睾丸间质细胞{促黄体生成素受体(Lhcgr)、高密度脂蛋白受体(Scarb1)、类固醇合成急性调节蛋白(Star)、胆固醇侧链裂解酶(Cyp11a1)、3β-羟基类固醇脱氢酶1(Hsd3b1)、17α-羟化酶/20-裂解酶(Cyp17a1)、17β-羟基类固醇脱氢酶3(Hsd17b3)、类固醇生成因子-1(Nr5a1)和胰岛素样生长因子3(Insl3)}和支持细胞{促卵泡激素受体(Fshr)、Sry相关的高迁移率族群基因9(Sox9)和抗苗勒管激素(Amh)}基因的表达水平和Westernblot(WB)测量(LHCGR、CYP17A1、HSD17B3、AMH、BAX和BCL2)的蛋白水平。上述的指标共同评估宫内BPA暴露对胎儿睾丸间质细胞和支持细胞的影响。
实验结果:
体内实验研究发现,BPA不影响孕鼠体重。BPA呈剂量依赖性降低雄性仔鼠血清的睾酮水平,与对照组比较,40mg/kg和400mg/kg剂量的BPA组有显著差异。
BPA不影响多核原始生殖细胞的数量。免疫组织化学染色分析显示,BPA剂量依赖地减少雄性仔鼠的胎儿睾丸间质细胞CYP11A1阳性细胞数量,与对照组比较,40mg/kg和400mg/kg剂量的BPA组有显著差异,这表明BPA抑制胎儿睾丸间质细胞的发育。与对照组比较,胎儿支持细胞SOX9阳性的细胞数量没有变化,表明BPA不影响支持细胞数量。
PCNA和CYP11A1荧光化学共染色结果表明BPA剂量依赖性地抑制胎儿睾丸间质细胞的增殖。BPA影响胎儿睾丸间质细胞的细胞簇分布,与对照组比较,40mg/kg和400mg/kg剂量的BPA显著地增加了胎儿睾丸间质细胞单个细胞簇的比例,而4mg/kg、40mg/kg和400mg/kg剂量的BPA显著地降低了胎儿睾丸间质细胞小细胞簇(2-4个细胞/簇)的比例,提示BPA促进胎儿睾丸间质细胞早期分化。
BPA在40mg/kg和400mg/kg的剂量下调胎儿睾丸间质细胞的Insl3和Hsd17b3及其蛋白质的表达。400mg/kg的BPA还下调胎儿睾丸间质细胞(Lhcgr、Cyp11a1和Cyp17a1)和支持细胞(Amh)及其蛋白质的表达,提示BPA影响胎儿睾丸的发育,特别是胎儿睾丸间质细胞的发育,BPA也影响胎儿支持细胞的功能。
实验结论:
总之,目前的研究表明,BPA宫内暴露抑制雄性仔鼠胎儿睾丸间质细胞和胎儿支持细胞的发育,可能会造成男性生殖道畸形的情况发生。
双酚A(BisphenolA,BPA)作为生产环氧树脂和聚碳酸酯的原材料,广泛应用于电子元件、纸张涂料、染料、医疗器械、餐具和婴儿用品的生产。现在BPA污染十分严重。BPA具有类雌激素样作用,虽然其生物活性大约是雌二醇的万分之一,但是还可以影响内分泌系统和生殖系统,是一种潜在的内分泌干扰物,还可能与男性生殖道的异常发育有关。胎儿睾丸主要含三种重要的细胞:胎儿睾丸间质细胞、胎儿支持细胞和原始精细胞。胎儿睾丸间质细胞是男性睾丸内一种重要的内分泌细胞,对于男性生殖道的正常发育至关重要。胎儿睾丸间质细胞的主要功能是合成雄激素睾酮和胰岛素样因子3;胎儿支持细胞主要分泌抗苗勒管激素。胎儿睾丸间质细胞的发育也受到胎儿睾丸其他细胞(如胎儿支持细胞和精细胞)的影响。目前,宫内暴露于BPA对胎儿睾丸细胞(特别是胎儿睾丸间质细胞和胎儿支持细胞)发育的影响尚不清楚。本实验的目的是研究BPA宫内暴露如何影响胎儿睾丸的发育以及其机制。
实验方法:
将妊娠SD大鼠随机分为4组:对照组(玉米油)、处理组(4mg/kg、40mg/kg和400mg/kg剂量的BPA,其中BPA溶于玉米油中),每组6只。到妊娠第12天,处理组分别灌胃4mg/kg、40mg/kg和400mg/kg剂量的BPA,对照组灌胃等量的玉米油。每天对每只雌性SD孕鼠进行一次称重,同时对动物的活动状态进行观察记录。到妊娠第21天,取雄性仔鼠,称重,记录雌雄比,取仔鼠血清测睾酮,取出睾丸,分离每对睾丸,一侧睾丸用波恩氏固定液(Bouin’s)浸泡,用苏木精-伊红组化染色法(hematoxylin-eosinstaining,HE)测量多核原始生殖细胞数目;用免疫组化染色胎儿睾丸间质细胞进行生物标记(细胞色素P450胆固醇侧链切割酶,CYP11A1和支持细胞标记物SOX9)来进行免疫组织化学分析测量仔鼠睾丸间质细胞数目、细胞大小和细胞群分布,用CYP11A1-增殖标记物和增殖细胞核抗原(PCNA)共染色进行免疫荧光化学分析胎鼠睾丸间质细胞增殖情况。对侧睾丸冷冻来提取RNA,用实时荧光定量核酸扩增检测(qPCR)实时定量测量胎儿睾丸间质细胞{促黄体生成素受体(Lhcgr)、高密度脂蛋白受体(Scarb1)、类固醇合成急性调节蛋白(Star)、胆固醇侧链裂解酶(Cyp11a1)、3β-羟基类固醇脱氢酶1(Hsd3b1)、17α-羟化酶/20-裂解酶(Cyp17a1)、17β-羟基类固醇脱氢酶3(Hsd17b3)、类固醇生成因子-1(Nr5a1)和胰岛素样生长因子3(Insl3)}和支持细胞{促卵泡激素受体(Fshr)、Sry相关的高迁移率族群基因9(Sox9)和抗苗勒管激素(Amh)}基因的表达水平和Westernblot(WB)测量(LHCGR、CYP17A1、HSD17B3、AMH、BAX和BCL2)的蛋白水平。上述的指标共同评估宫内BPA暴露对胎儿睾丸间质细胞和支持细胞的影响。
实验结果:
体内实验研究发现,BPA不影响孕鼠体重。BPA呈剂量依赖性降低雄性仔鼠血清的睾酮水平,与对照组比较,40mg/kg和400mg/kg剂量的BPA组有显著差异。
BPA不影响多核原始生殖细胞的数量。免疫组织化学染色分析显示,BPA剂量依赖地减少雄性仔鼠的胎儿睾丸间质细胞CYP11A1阳性细胞数量,与对照组比较,40mg/kg和400mg/kg剂量的BPA组有显著差异,这表明BPA抑制胎儿睾丸间质细胞的发育。与对照组比较,胎儿支持细胞SOX9阳性的细胞数量没有变化,表明BPA不影响支持细胞数量。
PCNA和CYP11A1荧光化学共染色结果表明BPA剂量依赖性地抑制胎儿睾丸间质细胞的增殖。BPA影响胎儿睾丸间质细胞的细胞簇分布,与对照组比较,40mg/kg和400mg/kg剂量的BPA显著地增加了胎儿睾丸间质细胞单个细胞簇的比例,而4mg/kg、40mg/kg和400mg/kg剂量的BPA显著地降低了胎儿睾丸间质细胞小细胞簇(2-4个细胞/簇)的比例,提示BPA促进胎儿睾丸间质细胞早期分化。
BPA在40mg/kg和400mg/kg的剂量下调胎儿睾丸间质细胞的Insl3和Hsd17b3及其蛋白质的表达。400mg/kg的BPA还下调胎儿睾丸间质细胞(Lhcgr、Cyp11a1和Cyp17a1)和支持细胞(Amh)及其蛋白质的表达,提示BPA影响胎儿睾丸的发育,特别是胎儿睾丸间质细胞的发育,BPA也影响胎儿支持细胞的功能。
实验结论:
总之,目前的研究表明,BPA宫内暴露抑制雄性仔鼠胎儿睾丸间质细胞和胎儿支持细胞的发育,可能会造成男性生殖道畸形的情况发生。