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背景
前期课题组研究PBA类似物和七元含氮氧杂环化合物具有抑制内质网应激提高细胞生存率的作用。
目的：脑缺血再灌注损伤(CIRI)是一个复杂的病理生理过程，所以多机制保护作用对于脑缺血再灌注损伤的治疗具有重大意义。PBA类似物和七元含氮氧杂环化合物对抑制内质网应激和自噬具有双重抑制作用。本论文拟通过对课题组前期设计合成的32个化合物筛选，得到抑制内质网应激和自噬的最佳双重抑制剂，考察对脑缺血再灌注损伤的保护作用。
方法及结果：
第一部分：PBA类似物和七元含氮氧杂环化合物对细胞自噬作用的研究
方法:
1.生存率活性筛选：利用CCK8实验初步测定化合物对细胞生存率的影响。双氧水(H2O2)刺激大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)建立自噬模型，化合物孵育24h后，加入双氧水(H2O2)损伤，测定化合物对细胞生存率的影响。对化合物进行细胞毒性筛选，优选高效低毒的化合物。
2.自噬活性筛选：利用上述模型，用化合物孵育1h后，加入双氧水(H2O2)损伤，利用westernblot检测Beclin-1，Atg7，LC3相关自噬蛋白。结合课题组前期对内质网应激抑制实验结果，筛选出PBA类似物F和七元含氮氧杂环化合物g进行下一步研究。
3.化合物F和g在细胞层面上自噬活性与机制研究：利用细胞免疫荧光检测化合物F和g对LC3和PDI的影响。利用AnnexinV/PI双染法检测化合物F和g在抑制自噬下对细胞凋亡的影响。利用westernblot法检测化合物影响通路AMPK/mTOR信号通路的自噬机制。
结果：
1.生存率活性筛选实验结果表明，32个化合物均无细胞毒性。
2.自噬活性筛选实验结果表明，给药组自噬相关蛋白Benclin-1，Atg7，LC3的表达，与模型组相比均有不同程度的下降。尤其是化合物F和g具有较强的抑制细胞自噬，提高细胞生存率的作用。
3.细胞免疫荧光实验结果：化合物F和g可以降低LC3和PDI的表达，即抑制自噬和内质网应激。AnnexinV/PI双染法实验结果表明化合物F和g可以通过抑制内质网应激和自噬降低细胞的凋亡率。化合物F和g也能通过降低磷酸化的AMPK和升高磷酸化的mTOR来抑制自噬。
第二部分：PBA类似物F和七元含氮氧杂环化合物g在脑缺血再灌注损伤中双重抑制内质网应激和自噬的研究
方法：
1.化合物F和g在脑缺血再灌注细胞层面的研究：用2-脱氧-右旋-葡萄糖(2-DG)和寡霉素建立PC12细胞ATP缺失模型。CCK8测细胞存活率，加入2-DG和寡霉素10min、30min、1h后测细胞的存活率。通过wsternblot测内质网应激蛋白GRP78和自噬蛋白LC3的表达情况。
2.化合物F和g在脑缺血再灌注动物层面研究：建立大鼠MCAO模型，腹腔注射(30mg/kg)，再灌注24h后进行神经评分和大脑样品TTC染色，研究化合物F和g对CIRI的保护作用。
结果：
1.在细胞ATP缺失模型中，给2-DG和寡霉素10min后细胞存活率没有明显的改变，30min后开始有明显下降，1h后细胞存活率下降至60%左右。在细胞ATP缺失1h后，加入化合物F和g，细胞存活率明显升高，GRP78蛋白和LC3蛋白表达下降，即双重抑制内质网应激和自噬。
2.建立大鼠MCAO模型，化合物F和g都可以使脑缺血面积明显减少，显著降低神经评分。
结论：
1.从17个PBA类化合物和15个七元含氮氧化合物中筛选出具有较强抑制自噬作用的化合物F和g，并且同时也具有较强的抑制内质网应激的效果。化合物F和g通过AMPK/mTOR通路抑制自噬，提高细胞生存率。
2.发现化合物F和g具有抑制内质网应激和自噬的双重抑制的效果。与单一抑制剂相比，具有更好的成药前景。并且具有小分子易透过血脑屏障的特性可以选择方便的腹腔注射给药。这些优势使治疗CIRI具有更好的前景。
前期课题组研究PBA类似物和七元含氮氧杂环化合物具有抑制内质网应激提高细胞生存率的作用。
目的：脑缺血再灌注损伤(CIRI)是一个复杂的病理生理过程，所以多机制保护作用对于脑缺血再灌注损伤的治疗具有重大意义。PBA类似物和七元含氮氧杂环化合物对抑制内质网应激和自噬具有双重抑制作用。本论文拟通过对课题组前期设计合成的32个化合物筛选，得到抑制内质网应激和自噬的最佳双重抑制剂，考察对脑缺血再灌注损伤的保护作用。
方法及结果：
第一部分：PBA类似物和七元含氮氧杂环化合物对细胞自噬作用的研究
方法:
1.生存率活性筛选：利用CCK8实验初步测定化合物对细胞生存率的影响。双氧水(H2O2)刺激大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)建立自噬模型，化合物孵育24h后，加入双氧水(H2O2)损伤，测定化合物对细胞生存率的影响。对化合物进行细胞毒性筛选，优选高效低毒的化合物。
2.自噬活性筛选：利用上述模型，用化合物孵育1h后，加入双氧水(H2O2)损伤，利用westernblot检测Beclin-1，Atg7，LC3相关自噬蛋白。结合课题组前期对内质网应激抑制实验结果，筛选出PBA类似物F和七元含氮氧杂环化合物g进行下一步研究。
3.化合物F和g在细胞层面上自噬活性与机制研究：利用细胞免疫荧光检测化合物F和g对LC3和PDI的影响。利用AnnexinV/PI双染法检测化合物F和g在抑制自噬下对细胞凋亡的影响。利用westernblot法检测化合物影响通路AMPK/mTOR信号通路的自噬机制。
结果：
1.生存率活性筛选实验结果表明，32个化合物均无细胞毒性。
2.自噬活性筛选实验结果表明，给药组自噬相关蛋白Benclin-1，Atg7，LC3的表达，与模型组相比均有不同程度的下降。尤其是化合物F和g具有较强的抑制细胞自噬，提高细胞生存率的作用。
3.细胞免疫荧光实验结果：化合物F和g可以降低LC3和PDI的表达，即抑制自噬和内质网应激。AnnexinV/PI双染法实验结果表明化合物F和g可以通过抑制内质网应激和自噬降低细胞的凋亡率。化合物F和g也能通过降低磷酸化的AMPK和升高磷酸化的mTOR来抑制自噬。
第二部分：PBA类似物F和七元含氮氧杂环化合物g在脑缺血再灌注损伤中双重抑制内质网应激和自噬的研究
方法：
1.化合物F和g在脑缺血再灌注细胞层面的研究：用2-脱氧-右旋-葡萄糖(2-DG)和寡霉素建立PC12细胞ATP缺失模型。CCK8测细胞存活率，加入2-DG和寡霉素10min、30min、1h后测细胞的存活率。通过wsternblot测内质网应激蛋白GRP78和自噬蛋白LC3的表达情况。
2.化合物F和g在脑缺血再灌注动物层面研究：建立大鼠MCAO模型，腹腔注射(30mg/kg)，再灌注24h后进行神经评分和大脑样品TTC染色，研究化合物F和g对CIRI的保护作用。
结果：
1.在细胞ATP缺失模型中，给2-DG和寡霉素10min后细胞存活率没有明显的改变，30min后开始有明显下降，1h后细胞存活率下降至60%左右。在细胞ATP缺失1h后，加入化合物F和g，细胞存活率明显升高，GRP78蛋白和LC3蛋白表达下降，即双重抑制内质网应激和自噬。
2.建立大鼠MCAO模型，化合物F和g都可以使脑缺血面积明显减少，显著降低神经评分。
结论：
1.从17个PBA类化合物和15个七元含氮氧化合物中筛选出具有较强抑制自噬作用的化合物F和g，并且同时也具有较强的抑制内质网应激的效果。化合物F和g通过AMPK/mTOR通路抑制自噬，提高细胞生存率。
2.发现化合物F和g具有抑制内质网应激和自噬的双重抑制的效果。与单一抑制剂相比，具有更好的成药前景。并且具有小分子易透过血脑屏障的特性可以选择方便的腹腔注射给药。这些优势使治疗CIRI具有更好的前景。