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研究背景与目的：肠球菌是目前医院内感染的主要病原菌之一，常引起免疫功能低下者的感染。肠球菌是多重耐药菌并可获得和传递耐药性，是当今细菌性感染的治疗难题之一。随着多耐药肠球菌的逐年增加，特别是对万古霉素耐药肠球菌的出现，这些肠球菌所引起的感染给临床治疗带来困难并且很难根除。抗菌药物的联合使用成为治疗肠球菌感染的不多的治疗方案之一，尤其对于免疫功能低下者的合并感染更是重要的治疗措施。氟喹诺酮类抗菌药物具有抗菌谱广，不良反应少的优点被广泛应用于临床。近年来，随着氟喹诺酮类抗菌药物在临床的广泛应用，肠球菌对此类药物的耐药性也在逐年增加，单一用药较难奏效，因此，本文就肠球菌对氟喹诺酮类药物的耐药机理和氟喹诺酮类药物和氨苄西林联合用药进行了部分抗菌药物的体外实验研究，以期为临床联合用药治疗肠球菌严重感染提供实验依据。
方法：全部试验菌株经VITEK-AMS鉴定。用CLSI/NCCLS推荐的琼脂稀释法从临床标本分离株中筛选出对高浓度庆大霉素(500μg/ml)敏感的粪肠球菌31株，屎肠球菌22株；对高浓度庆大霉素耐药的粪肠球菌30株，屎肠球菌23株，共计106株。
琼脂稀释法药敏试验和肠球菌多重耐药泵抑制剂利血平对提高环丙沙星(Cip)敏感性试验：根据CLSI/NCCLS推荐的琼脂稀释方法测试了106株肠球菌对氨苄西林(Amp)和左氧氟沙星(Levo)的最小抑菌浓度(MIC)。测试了对高浓度庆大霉素耐药的30株粪肠球菌对加替沙星(Gati)、莫西沙星(Moxi)和Cip的MIC。同时测试了在M-H琼脂中加入终浓度为20μg/ml利血平后CipMIC值的改变。
Levo和Amp联合药敏试验：采用棋盘微量稀释法进行。Levo的MIC范围是0.12～64μg/ml；Amp的MIC范围是1～64μg/ml。
杀菌曲线试验：根据棋盘微量稀释法联合药敏试验结果，按照NCCLS指南进行Levo和Amp体外杀菌曲线试验。
对Amp耐药肠球菌的β-内酰胺酶测定：用nitrocefin纸片检测β-内酰胺酶。多聚酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析：检测对Levo与Cip耐药的30株粪肠球菌和10株屎肠球菌gyrA基因有无碱基发生突变，并通过基因测序确定具体突变类型。
结果：药敏质控结果均在CLSI/NCCLS规定的范围内。106株肠球菌对Amp、Levo的总耐药率分别为82.1％、57.5％。Amp对粪肠球菌和屎肠球菌的耐药率分别为75.4％、91.1％。Levo对粪肠球菌和屎肠球菌的耐药率分别为49.2％、68.9％，中介度为11.5％、11.1％。Levo对粪肠球菌的MIC50和MIC90分别为4μg/ml和16μg/ml；对屎肠球菌的MIC50和MIC90分别为8μg/ml和32μg/ml。Amp对粪肠球菌的MIC50和MIC90分别为32μg/ml和64μg/ml；对屎肠球菌的MIC50和MIC90分别为64μg/ml和128μg/ml。30株粪肠球菌对Cip、Gati、Moxi的耐药率分别为56.6％、23.3％、6.7％；对Cip、Gati、Moxi的MIC50和MIC90分别为16μg/ml和64μg/ml、2μg/ml和8μg/ml、0.5μg/ml和lμg/ml。
用nitrocefin纸片对Amp耐药(MIC≥16μg/ml)的87株肠球菌(粪肠球菌46株，屎肠球菌41株)进行β-内酰胺酶测定，总阳性率为3.4％。
棋盘微量稀释法联和药敏试验结果表明对Levo敏感，Amp敏感或耐药(AmpMIC≤32μg/ml)的肠球菌具有协同或累加作用，从中选取2株具有协同作用的粪肠球菌和2株没有协同作用的屎肠球菌进行杀菌曲线实验。
PCR-SSCP分析：40株对Levo和Cip同时耐药肠球菌(30株粪肠球菌、10株屎肠球菌)、粪肠球菌ATCC29212、1株对Levo和Cip敏感的粪肠球菌均扩增出gyrA基因。其中有24株粪肠球菌和4株屎肠球菌的单链泳动带与粪肠球菌ATCC29212和敏感菌株的单链泳动带不同。从电泳条带异常的粪肠球菌和屎肠球菌中各随机抽取2株细菌的PCR产物进行测序，测序结果与粪肠球菌ATCC29212和基因库(Genebank)中的相关菌株数据进行比较。其中粪肠球菌在第87位氨基酸上有密码子改变：gaa→gga；屎肠球菌在第83位氨基酸上有密码子改变：agt→tat。这些突变均可引起氨基酸的改变。
结论：实验结果表明肠球菌对Amp具有很高的耐药性，在80％以上。对较早使用的氟喹诺酮类抗菌素，Cip、Levo的耐药率在50％～60％之间。其中，屎肠球菌比粪肠球菌的耐药率要高。对于最近用于临床的Gati和Moxi具有较好的敏感性，特别是对于Moxi，肠球菌的敏感率在90％以上，这和国内外的研究结果一致。对Amp耐药肠球菌的β-内酰胺酶阳性率较低说明肠球菌对Amp的耐药性主要不是因为产β-内酰胺酶所引起的。棋盘微量稀释法联和药敏试验结果表明，Levo和Amp之间是否存在协同作用主要取决于Levo和Amp各自的MIC值，与肠球菌对高浓度氨基糖苷类药物是否敏感无关。Levo和Amp在屎肠球菌中协同和累加作用少于粪肠球菌，是由于它们对两种药物的MIC值比粪肠球菌高导致的。用PCR-SSCP法检测40株肠球菌的gyrA基因并通过测序分析，发现有70％(28株)肠球菌碱基发生了突变，说明gyrA基因喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)突变是肠球菌对氟喹诺酮类药物耐药的重要原因，此外还有药物泵出等耐药机制的存在。