目的 角质细胞生长因子2(keratinocyte growth factor 2，KGF2)是成纤维细胞生长因子家族中的23个成员之一，又称为成纤维生长因子10(fibroblast growth factor10，FGF10)。人KGF2是1997年Emoto等首先从人的肺中分离出的具有肝素结合特异性的单链多肽，因与1989年发现的KGF在结构、性质、功能等方面的同源性而得名。KGF2包含208个氨基酸，其N端是由39个疏水氨基酸组成的信号肽序列，其分子结构与小鼠的同源性达96％。KGF2由成纤维细胞和其它间充质来源的细胞分泌，特异性作用表达于上皮细胞表面的酪氨酸激酶受体，以间质-上皮相互作用的旁分泌方式有效地促进各种来源上皮细胞的增殖、移行和分化,因而有可能作为未来临床上治疗难治性上皮组织损伤和调节上皮来源器官发育的多功能生物制剂。国外关于KGF2的研究多涉及生物学特性及功能方面，国内有关KGF2研发的报道亦不多见，本实验试图构建高效原核表达系统，分析其在不同诱导条件下的表达量，并利用镍亲和层析一步法获得BL21/pET-30a(+)-hKGF2中高纯度的重组蛋白，用于生物学功能的研究。 KGF2生物学功能广泛，自发现以来发展迅速。研究发现，它不仅可以直接作用于上皮细胞促进伤口边缘细胞再生和损伤修复，还可通过间接刺激其它细胞因子的分泌促进肉芽组织的形成，减少疤痕的形成。文献报道KGF2对多种因素如急慢性炎症、溃疡、物理化学烧伤等引起的组织器官损伤的修复过程发挥重要作用，如对放化疗引起的小鼠口腔粘膜炎、胃肠道粘膜损伤及溃疡性结肠炎具有明显的治疗作用；对小鼠皮肤切割伤和大鼠皮肤烫伤的愈合亦有明显的促进作用；且KGF2在整个脊椎动物的胚胎发育过程中起着不可替代的作用，参与并调控多种组织和器官的形成和分化，如在四肢、肺．支气管、牙龈、胰腺、脑垂体、眼睑和皮肤及下颌腺等器官的发育和成熟过程中的重要作用。美国人类基因组公司(Human Genome Sciences,HGSI)开发的Repifemin(KGF2)针对难治性上皮损伤进行的多项临床试验，证实了KGF2良好的稳定性及安全性。因而KGF2将是一种继表皮生长因子之后更具开发和应用前途的多功能制剂，前景良好。本实验的研究目的是建立含有hKGF2的重组表达载体，并筛选不同诱导条件下目的蛋白表达量较高的高效稳定表达菌株，优化表达及纯化方法，利用相应方法纯化出高纯度重组蛋白，并检测其生物学活性，为KGF2的大规模生产及应用研究奠定基础。 方法及结果 1．hKGF2的基因克隆及序列分析根据文献报道和Genbank上人KGF2基因序列，设计一对扩增人KGF2基因的引物，上游引物含有EcoRI位点和ATG起始密码子，下游含有BamHI位点和终止密码子的反密码子TTA。 收集5％CO<,2>、37℃传代培养下生长状态良好的人胚胎肺成纤维细胞，采用异硫氰酸胍法提取培养的细胞总RNA，并逆转录合成hKGF2 cDNA第一链，再以完整的cDNA和上述引物用PCR方法扩增hKGF2基因片断；用低熔点琼脂糖法分离和纯化PCR产物后与pMD18-T载体相连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细菌涂布于含100ug/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，菌落PCR及限制性酶谱分析筛选阳性克隆。阳性质粒经Invitrogen生物技术有限公司测序，所克隆基因片段与预期的完全一致，成功构建了pMD18-hKGF2重组克隆载体。 2．成熟人KGF2在pBV220表达载体中的表达及鉴定将pMD18-hKGF2重组克隆载体及原核表达载体pBV220分别用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切，分别用低熔点琼脂糖法分离和纯化目的基因片段hKGF2集载体片段后，经T4DNA酶连接，构建重组表达载体pBV220-hKGF2。 将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌涂布于含100ug/ml氨苄青霉素的LB固体培养基L30℃培养过夜，利用菌落PCR初步筛选后，挑取阳性克隆菌株接种于LA培养基中30℃振荡过夜培养。采用树脂法小量提取质粒，EcoRI、BamHI双酶切鉴定，确定定向插入的阳性克隆。 吸取阳性菌液按1:100接种至含0.2％葡萄糖及100 ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃振摇培养，当菌液OD<,600>达0.6时立即移至42℃，热诱导4h后，4000rpm，4℃离心，10min后收集细菌。用Bio-rad垂直电泳系统进行SDS-PAGE和Western Blotting分析重组蛋白，凝胶图像扫描系统分析结果显示重组蛋白的表观分子量约23KD，和理论值稍有差异，可能受蛋白质折叠后所带电荷、酸碱度及受电泳性质等因素影响，重组蛋白表达量约占菌体总蛋白的10％。将酶切鉴定阳性的重组质粒pBV220-hKGF2分别转化E．coli DH5a、E．coliJM109、E．coli BL21(DE3)，并优化表达条件，结果发现在E．coli JMl09中最大表达量约占菌体总蛋白15％。 按上述方法扩增表达菌株，离心收集细菌，超声破碎，离心分别收集上清和沉淀，进行14％SDS-PAGE电泳，发现表达产物以可溶性蛋白的形式存在于裂解上清中，而非存在于包涵体内。 3．成熟人KGF2在pET-30a(+)载体中的表达、鉴定、纯化及生物学活性检测由于hKGF2在pBV220表达载体中的表达量较小不利于后续的纯化及大规模生产及应用研究，实验又选用pET-30a(+)载体表达目的蛋白。为将hKGF2基因克隆入pET-30a(+)中，必须重新设计一对引物，上游含有Nde Ⅰ位点及保护碱基GGAATTC，下游含有BamH Ⅰ位点及保护碱基CG。以测序正确的pMD18-hKGF2重组克隆载体为模板，以新合成引物重新扩增hKGF2基因；分别用Nde Ⅰ和BarnHⅠ分别对hKGF2基因PCR产物及原核表达载体pET-30a(+)进行双酶切后相连接、转化非表达宿主大肠杆菌DH5a，涂布于含有25ug/ml卡那霉素的LB固体培养基上，按上述同样方法鉴定筛选阳性重组克隆。 制备表达宿主BL21(DE3)感受态细胞，提取酶切鉴定阳性的pET-30a(+)-hKGF2重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞接种于含有25ug/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。从新鲜的培养平板中挑取单克隆菌落，将含有pET-30a(+)-hKGF2重组质粒的BL21(DE3)表达菌接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中37℃振荡至OD<,600>=0.8时，终浓度为1mM的IPTG诱导表达4h，SDS-PAGE和Western Blotting分析重组蛋白，分析结果显示重组蛋白的表观分子量约23KD，和理论值稍有差异，可能受蛋白质折叠后所带电荷、酸碱度及受电泳性质等因素影响，重组蛋白表达量约占菌体总蛋白25％。 为研究重组hKGF2的生物学活性，对重组pET-30a(+)-hKGF2按上述方法扩增收集进行溶解性分析及纯化， SDS-PAGE电泳显示重组蛋白完全存在于超生破碎上清中，收集上清利用Ni-NTA纯化试剂盒纯化重组蛋白，SDS-PAGE电泳分析纯化结果。MTF法检测结果显示纯化后的重组蛋白在浓度为0.5ng/ml-20 ng/ml之间表现出促人胚胎肾上皮细胞的增殖作用。 结论 1．成功克隆了hKGF2基因，序列分析显示，克隆基因序列与文献报道一致。 2．构建了重组原核表达载体pBV220-hKGF2及pET-30a(+)-hKGF2，均获得稳定表达的工程菌株，表达目的蛋白分别约占菌体总蛋10％～15％和25％；且均以可溶性形式存在。 3．初步摸索优化了重组hKGF2的表达条件。 4．获得纯化后的重组蛋白hKGF2纯度达95％以上。 5．纯化后的重组蛋白显示出对人胚胎。肾上皮细胞有促有丝分裂作用。