论文部分内容阅读
目的：
1.预测EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)的B细胞表位,可为其单克隆抗体的制备及表位疫苗设计等研究提供理论依据.
2.经过B细胞表位预测分析,获得了3个B细胞表位多肽,分别构建含预测B细胞表位多肽的原核重组质粒pET32a/ozlf-67、pET32a/ozlf-69和pET32a/ozl-f-71,采用6个组氨酸标签(His.tag)表达表位融合蛋白,并用Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71.同时,纯化pET32a(+)表达的His蛋白用于动物免疫.
3.将纯化的蛋白ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71和His蛋白分别免疫小鼠,制备鼠血清抗体,采用间接ELISA方法初步分析表位多肽的免疫原性.并用B95-8细胞作为包被抗原,检测表位融合蛋白鼠血清抗体效价,以进一步探讨EBVLMP2 B细胞表位诱导抗体与EBV抗原结合能力,为EBV相关疾病的疫苗设计及研制相关诊断试剂奠定基础.
方法：
1. 以EBV标准株(B95-8)LMP2的完整氨基酸序列为基础,采用SOPMA、GOR、nnPredict和HNN 4种方法分别预测LMP2的二级结构;并结合其跨膜区域、亲水性、表面可及性、抗原性、极性和柔韧性等综合分析预测EBV LMP2可能的B细胞表位.
2.选取预测的B细胞表位多肽序列,按原核系统偏爱的氨基酸密码子优化,委托生物技术公司合成寡核苷酸,退火获得目的基因,并将目的基因克隆至原核表达载体pET32a(+)多克隆位点内.将此重组载体转化Ecoli BL21(DE3)表达融合蛋白,并经SDS-PAGE、Western Blot分析鉴定.用Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69、ozlfi-71及His蛋白.
3.用纯化的蛋白ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71及His蛋白和PBS分别作为免疫原,分别于第Ow、2w和3w免疫:ICR小鼠(12 只/组),其中以His蛋白和PBS作为阴性对照和空白对照组.于免疫后第Ow、3w和6w,每次每组取4只小鼠行眶静脉取血,制备免疫血清抗体.采用间接ELISA方法检测ozlf-67、ozlf-69和ozlf-71蛋白在不同免疫时间的抗体效价,免疫原性,及其诱导抗体与EBV抗原的结合能力.
结果：
1.SOPMA、GOR、nnPredict和HNN 4种方法对EBVLMP2二级结构的预测均表明,二级结构中柔性区域以无规卷曲为主少见转角.B细胞表位可能位于其N端199～209、318～322和381～391区段.
2.酶切鉴定和核苷酸测序表明,成功构建了3个编码B细胞表位的原核表达质粒.SDS-PAGE分析表明,在37℃1.0mM IPTG作用下诱导4h均能很好地表达目的蛋白,相对分子质量(Mr)约为20 kDa,与预期Mr大小吻合;蛋白表达量均约占细菌总蛋白量的20﹪.Western Blot结果显示单一明显条带,与SDS-PAGE中位置吻合.用Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化得到表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71和pET32a(+)空载体所表达的His蛋白,纯度均达95﹪以上.
3.3种表位融合蛋白免疫ICR小鼠均可获得高效价的免疫血清.经间接ELISA方法检测,表位融合蛋白均能刺激机体产生抗体:抗体效价随免疫次数增加而升高:所诱导产生的抗体均能与EBV抗原结合,其中融合蛋白ozlf-67(N端199～209位)结合能力最强.
结论：
1.预测并筛选了3个可能的EBV LMP2 B细胞表位.
2. 通过分子克隆分别成功构建了含B细胞表位的重组质粒pET32a/ozlf-67、pET32a/ozlf-69和pET32a/ozlf-71;在原核表达系统内分别高效表达了表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71:通过亲和层析法得到了纯化的表位融合蛋白.
3.表位融合蛋白免疫ICR小鼠血清学检测,表明预测的3个B细胞表位融合蛋白均能刺激机体产生抗体,其具有较强的免疫原性,抗体效价随免疫次数增加而升高;表位融合蛋白诱导所产生的抗体均能与EBV抗原结合,为EBV相关疾病基因工程疫苗的设计和诊断试剂盒的研制提供了理论基础和实验依据.