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创伤愈合是指机体皮肤等组织由于外在或内在因素造成离断或缺损,需要进行组织再生及功能修复的过程,主要包括炎症期、增生期、重塑期三个阶段。炎症期表现以巨噬细胞为主的炎性反应,增生期组织通过成纤维细胞等上皮细胞的增殖与迁移进行肉芽组织修复和再生,重塑期胶原纤维通过合成与分解进行重新排列。目前治疗手段以化学药物为主,大多由于过度抑制炎症反应及过度增生导致瘢痕形成。据《中国药典》记载,五倍子（Rhus chinensis Mill.）具有治疗外伤出血和皮肤湿烂的作用,单宁酸（Tannic acid,TA）在五倍子鞣质中占60%以上,但目前无文献报道单宁酸对皮肤损伤的治疗作用。因此,本研究拟评价单宁酸对大鼠机械损伤创面愈合的影响,并确定其作用时期;通过巨噬细胞、成纤维细胞和外泌体,深入探讨单宁酸作用机制,挖掘其作用靶点,为临床应用提供基础数据。主要研究内容及结果如下:1.单宁酸对大鼠机械损伤创面的影响随机选择72只雄性大鼠,设置6个实验组,分别为空白组、模型组、云南白药组（0.5g/m L）和高、中、低剂量单宁酸组（2.0g/m L、1.0g/m L、0.5g/m L）。采用无菌打孔法制备大鼠机械损伤模型,观察各组创面情况,记录创面完全愈合所需时间,通过HE和Masson染色法观察创面皮肤组织愈合情况及胶原纤维的排列与分布,利用荧光定量试验（Real-time quantitative reverse transcription-PCR,RT-PCR）和酶联免疫吸附双抗体夹心（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）法分别测定各组大鼠皮肤和血清中炎症因子白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）及生长因子转化生长因子（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维生长因子（b FGF）、肝细胞生长因子（HGF）和纤维连接蛋白（FN）的表达。结果显示:（1）中低剂量TA可以促进皮肤创面结痂,缩短愈合时间。（2）在炎症期和增生期,中剂量TA组创面中性粒细胞的数量减少,有大量血管和毛囊;重塑期,云南白药组和低中剂量TA组创面胶原纤维和肌纤维排列整齐且紧密。（3）炎症期,TA下调了大鼠皮肤和血清中炎症因子IL-1β和IL-6的表达。（4）增生期,TA上调了b FGF和TGF-β蛋白水平的表达。以上结果表明,中低剂量单宁酸能提高创面愈合率,通过抑制IL-1β和IL-6的分泌来缓解炎症期的炎症反应,刺激bFGF和TGF-β的表达,诱导增生期血管数量增加,从而促进肉芽组织再生,完成创面愈合。单宁酸主要作用于创伤的炎症期和增生期。2.单宁酸对创伤炎症期巨噬细胞的影响及其作用机制体外选择巨噬细胞建立炎症反应模型,深入研究单宁酸对创伤炎症期的作用机理。利用脂多糖（LPS,1000ng/m L）诱导小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）发生炎症反应,评价单宁酸对RAW264.7细胞增殖、细胞因子的分泌及NF-κB/MAPKs信号通路的调节作用。结果显示:（1）24h内,TA对巨噬细胞的安全浓度范围为0-3.8n M,且0.06n M-0.24n M TA能显著增加细胞数量。（2）TA能抑制LPS诱导的炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β的转录,下调IL-6和TNF-α蛋白的表达。（3）TA能促进细胞核内b FGF、HGF和TGF-β基因转录,并诱导b FGF和HGF蛋白表达。（4）TA下调了IκB、p65和JNK磷酸化蛋白的表达量,抑制了NF-κB/JNK通路;TA上调了Erk1/2蛋白磷酸化水平,激活了Erk1/2信号通路。以上结果表明,单宁酸可以促进巨噬细胞增殖,通过抑制NF-κB/JNK信号通路,下调炎症因子IL-6、TNF-α和IL-β的表达,缓解炎症反应;激活Erk1/2通路,刺激生长因子b FGF和HGF的表达,诱导细胞修复。3.单宁酸对创伤增生期成纤维细胞的影响及其作用机制通过成纤维细胞,深入研究单宁酸对创伤增生期的作用机制。采用CCK-8法评价单宁酸对小鼠成纤维细胞（NIH 3T3）的增殖作用,利用划痕法建立机械损伤的体外细胞模型,测定24h内成纤维细胞的迁移率,并检测细胞自分泌生长因子的表达,通过Erk 1/2信号通路探讨单宁酸对增生期成纤维细胞的作用机制。结果表明:（1）24h内,TA对NIH 3T3细胞的安全浓度范围为0-7.6n M;在12h时,0.06n M-0.24n M TA对NIH 3T3细胞具有促增殖作用。（2）不同浓度TA能刺激NIH 3T3细胞中生长因子b FGF的分泌。（3）0.06n M和0.12n M TA能显著提高NIH 3T3细胞中p-Erk1/2的表达量,激活Erk 1/2信号通路。（4）不同浓度TA对NIH 3T3细胞的迁移能力无显著影响,TA诱导下巨噬细胞上清液能显著促进成纤维细胞迁移。以上结果表明,单宁酸能显著增加成纤维细胞的数量,促进b FGF分泌,激活Erk1/2信号通路,诱导肉芽组织增生;单宁酸对成纤维细胞的迁移功能无直接调节作用,但能诱导巨噬细胞分泌活性物质间接调节成纤维细胞的迁移能力。4.单宁酸诱导巨噬细胞源外泌体对成纤维细胞迁移功能的影响大量研究表明,细胞间的相互作用与信息传递依赖于外泌体功能的发挥,为研究单宁酸诱导下巨噬细胞源活性物质对成纤维细胞迁移功能的影响,本试验选择巨噬细胞源外泌体,研究其对成纤维细胞迁移功能的作用。首先采用超高速离心法提取分离RAW264.7细胞的外泌体,利用透射电镜和Western Blot法鉴定外泌体的结构及标志性蛋白CD81和TSG101。将收集的外泌体用PKH26进行标记并观察成纤维细胞对外泌体的内化作用,用划痕法测定不同处理组外泌体对成纤维细胞迁移能力的影响,最后分别采用Western Blot和高通量测序技术研究单宁酸对巨噬细胞源外泌体分泌机制和miRNA序列的影响。结果表明:（1）不同处理组外泌体均具有双层膜性结构,呈茶托状,粒径在30-150nm之间,且均检测到了标志性蛋白CD81和TSG101,可以用于后续研究。（2）各组外泌体均能被成纤维细胞摄取,主要分布于细胞核周围。（3）在划痕试验中,不同处理组外泌体均显著促进了NIH 3T3细胞迁移,其中单宁酸组迁移率最高。（4）单宁酸能刺激巨噬细胞源外泌体总蛋白含量和CD81、TSG101表达上升,上调p53蛋白磷酸化水平,促进下游steap3基因转录,对Rab5A、Rab27A、Rab27b转录水平无影响。（5）单宁酸刺激下巨噬细胞源外泌体miRNAs序列发生改变,共筛选到45个差异性miRNA,其中与细胞迁移相关基因miR-221-3p显著上调。以上结果表明,单宁酸通过激活p53信号通路,刺激巨噬细胞分泌大量富含miR-221-3p的外泌体,并进入成纤维细胞胞质中,从而促进细胞迁移。5.单宁酸诱导巨噬细胞源外泌体促进成纤维细胞迁移机制的研究为深入探究单宁酸外泌体促进成纤维细胞迁移的作用机理,首先通过划痕和Transwell试验确证miR-221-3p对细胞迁移功能的影响,然后利用软件筛选出miR-221-3p的靶基因并验证其迁移功能,最后通过双荧光素酶报告基因系统探究miR-221-3p与靶基因的结合位点,确定单宁酸诱导下巨噬细胞源外泌体促进成纤维细胞迁移功能的作用靶点。结果显示:（1）巨噬细胞与成纤维细胞间通过外泌体运输miR-221-3p基因,促使受体成纤维细胞中miR-221-3p高表达。（2）划痕和Transwell试验的结果证实,miR-221-3p能够显著促进成纤维细胞迁移。（3）经软件预测,CDKN1b可能是miR-221-3p的靶基因,miR-221-3p能够显著下调CDKN1b的转录和蛋白水平,且CDKN1b基因沉默后成纤维细胞迁移率显著上调。（4）双荧光素酶报告基因系统显示miR-221-3p能与CDKN1b 3’UTR特异性结合,显著下调荧光值。以上结果表明,在单宁酸刺激下巨噬细胞中miR-221-3p通过外泌体传递至成纤维细胞中,与CDKN1b 3’UTR特异性结合,下调CDKN1b基因表达,促进成纤维细胞迁移。综上所述,单宁酸可促进皮肤创伤愈合,主要作用于创伤的炎症期和增生期:在炎症期,单宁酸首先通过抑制巨噬细胞NF-κB信号通路,降低下游核内促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的转录,减少创面中性粒细胞浸润;其次,单宁酸还能激活巨噬细胞p53信号通路,促使细胞分泌富含抗炎miRNAs的外泌体,从而缓解炎症反应。在增生期,单宁酸能刺激成纤维细胞分泌b FGF,进一步激活Erk1/2信号通路转导,从而促进细胞增殖并形成新的血管;同时,成纤维细胞通过摄取富含miR-221-3p的巨噬细胞源外泌体,下调CDKN1b基因的表达,促进细胞迁移,诱导组织再上皮化。