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伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起多种动物共患的一种急性、热性传染病。猪是PRV主要宿主,其中患病仔猪临床特征主要为发热、神经症状等,死亡率较高,种猪多表现繁殖障碍。现阶段无有效治疗药物,疫苗免疫是猪伪狂犬病防控的核心手段。但自2011年底以来,我国各地区猪场出现PRV变异株并流行,养猪业的健康发展再次受到冲击。本研究首先从疑似患病猪病料中分离PRV流行株,经毒力鉴定及遗传进化分析,采用CRISPR/Cas9基因编辑系统辅助PRV同源重组,构建11K、g I、g E、28K四基因缺失株r PRV（FJ）-p EGFP,TK、11K、g I、g E、28K五基因缺失株r PRV（FJ）-5D以及分别重组了猪源细胞因子GM-CSF和CD40L的五基因缺失株r PRV（FJ）-GM-CSF和r PRV（FJ）-CD40L,再通过一系列动物试验比较所构建毒株的安全性和免疫原性,为PRV新型疫苗的研发与应用提供技术支撑。研究主要结果如下:1.伪狂犬病毒流行株的分离鉴定、致病力和免疫原性比较从全国部分地区取自患病仔猪的65份临床样品中分离并鉴定到1株伪狂犬病毒,来自福建地区,命名为PRV FJ株。在BHK-21细胞上传代至F10代,测得其TCID50为10-7.30/0.1m L。用猪源PRV标准阳性血清进行中和试验,结果显示分离的PRV FJ株能被PRV阳性标准血清中和,中和效价为1:128。将PRV FJ株与实验室前期分离保存的PRV XJ株和Fa株分别接种SPF小鼠,对其致病力进行比较,结果显示:PRV FJ株、XJ株和Fa株的LD50分别为102.29TCID50、103.21TCID50和103.97TCID50。将三株毒株均以1 LD50剂量接种SPF小鼠,FJ组小鼠最先出现临床症状,并在72h左右出现死亡,死亡1只,在96h及以后共死亡4只,存活2只;XJ和Fa组均在84h左右出现死亡,其中XJ组死亡2只,Fa组死亡1只;XJ组在96h及以后死亡4只,存活2只,Fa组在96h及以后死亡3只,存活3只。组织病理切片显示FJ组相关组织病变相对严重。以上结果表明PRV FJ株毒力最强。将三个毒株分别接种BHK-21细胞后收获病毒,测定病毒含量后将病毒液均稀释为10~7TCID50,然后使用0.5%甲醛灭活30h后与弗氏佐剂超声乳化混合,免疫小鼠28d时采集小鼠血清测中和抗体,测得FJ株、XJ株与Fa株诱导产生的平均中和抗体效价分别为1:26.7±7.0、1:16.3±7.2和1:21.7±9.6,表明PRV FJ株诱导小鼠产生的中和抗体水平最高,免疫原性较好。2.PRV FJ株全基因组序列测定及遗传进化分析取PRV FJ株F10代病毒液超滤浓缩后抽提DNA,以第三代测序平台Pac Bio SMRT结合二代MGISEQ-2000全基因组测序方式,最终拼接出大小为143703bp的全基因组序列,其GC含量为73.67%,含70个编码基因（Genbank登录号:MW286330）,并逐一进行了功能注释。FJ株与NCBI上15株PRV参考毒株全基因组的遗传进化分析表明,所有毒株分为欧美基因I型和亚洲基因II型两个大分支,FJ株与国内流行变异株均为基因Ⅱ型。分别构建FJ株与其余参考毒株主要毒力和免疫相关基因TK、PK、g B、g C、g D、g G、g H、g L、g M、g N、g I和g E的遗传进化树,结果显示FJ株的以上基因均位于基因Ⅱ型分支,其中g G基因与国内经典株处于同一亚分支,g E基因位于相对独立的一个亚分支,其余基因与国内变异株位于同一亚分支。全基因组序列同源性分析结果表明,PRV FJ株与国内2011年以后公布的PRV流行变异参考毒株同源性最高,介于99.9%-100.0%之间,与欧美毒株同源性最低,不大于96.0%。运用RDP4软件对PRV FJ株进行重组预测,结果显示在三个非编码区段发生了自然重组,且重组亲本株为HLJ8株和Ea株。使用相关分子生物学软件分别预测PRV Bartha、FJ、Ea三株毒株的g B、g C、g D三种糖蛋白的N-糖基化位点和潜在抗原位点,结果显示,三株PRV毒株的g B、g C蛋白的N-糖基化位点均一致,其中g B蛋白7个,g C蛋白8个,g D蛋白0个。FJ株三种糖蛋白B细胞线性表位序列与Ea株差异均较小,其g B、g D蛋白表位序列与Bartha株差异较小,g C蛋白表位序列与Bartha株差异显著。3.各PRV基因缺失株的构建及部分生物学特性分析根据PRV FJ株基因组序列,合成了g I基因上游、28K基因下游、TK基因上下游同源臂,以及融合蛋白基因序列T2A-6×His-GM-CSF和T2A-6×His-CD40L,并定向插入至p EGFP-C1载体中,构建了转移载体p EGFP-C1-g I28K、p EGFP-C1-TK、p EGFP-g I28K-GM-CSF、p EGFP-g I28K-CD40L。使用在线预测软件分别以g E、TK基因序列为模板,设计了特异性切割g E和TK基因的g RNA序列,并构建了psg-g E和psg-TK切割质粒。将转移载体和g RNA切割质粒共转染BHK-21细胞,12h后接种PRV FJ株,80%细胞病变后收获病毒液,稀释后接种BHK-21细胞,挑选绿色荧光嗜斑,连续进行三轮嗜斑纯化,最终获得了4株PRV基因缺失株:r PRV（FJ）-p EGFP株、r PRV（FJ）-5D株、r PRV（FJ）-GM-CSF株和r PRV（FJ）-CD40L株。分别对4株基因缺失株进行一步生长曲线绘制和嗜斑形态测定,结果显示:所构建的4株毒株生长曲线和嗜斑形态与亲本毒株基本一致。对4株基因缺失株连续传代至F21代,采用PCR扩增、TK基因测序、Western Blot等方法进行缺失基因（TK、11K、g I、g E、28K）和插入基因（GM-CSF、CD40L）的检测,结果显示,4株毒株缺失和插入基因在F1-F21代遗传稳定。将PRV FJ株与其基因缺失株以10~4TCID50滴度分别接种BHK-21和Vero细胞,比较不同时间两种细胞的病变程度,以及各基因缺失株和亲本株的增殖特性,结果显示:PRV FJ株对两种细胞的致病力均高于其基因缺失株;各PRV基因缺失株在两种细胞上的致病力均无较大差异。4.PRV基因缺失株安全性及免疫原性比较分别将r PRV（FJ）-p EGFP、r PRV（FJ）-5D、r PRV（FJ）-GM-CSF和r PRV（FJ）-CD40L株F21代以测得的单倍、10倍和10~3倍最低免疫剂量(即10~3、10~4和10~6TCID50)接种SPF小鼠进行安全性试验,每组6只,结果显示,r PRV（FJ）-p EGFP接种组以10~4和10~6TCID50剂量接种的小鼠全部死亡,以10~3TCID50剂量接种的小鼠仅存活2只,其余基因缺失株接种组均正常存活,安全性较好。存活的免疫接种组小鼠在14d后二免,并在二免后14d采集血清测定g B、g E、中和抗体效价及细胞因子IL2/IL-6/TNF-α/IFN-γ浓度。结果表明小鼠g B抗体均为阳性,g E抗体均为阴性。在IL-2水平上,免疫组与对照组差异不显著;免疫组IL-6、TNF-α和IFN-γ浓度均高于对照组。二免并攻毒后的小鼠组织病理切片显示,攻毒对照组脑、脾、肺病变明显,免疫组无病理变化。选择对小鼠安全性高的PRV基因缺失株r PRV（FJ）-5D、PRV（FJ）-GM-CSF和r PRV（FJ）-CD40L F21代以测得的单倍、10倍和100倍最低免疫剂量(即10~5、10~6和10~7TCID50)滴鼻接种3-4周龄PRV抗体阴性断奶仔猪进行安全性试验,每组5只,结果表明,在观察期内,所有基因缺失株接种组仔猪均正常存活,PRV FJ株攻毒对照组在攻毒后第5d开始死亡,7d内全部死亡。在免疫21 d内定期监测各基因缺失株单倍最低免疫剂量组g B、g E及中和抗体效价,结果表明:r PRV（FJ）-GM-CSF组、r PRV（FJ）-CD40L组g B抗体转阳速率高于r PRV（FJ）-5D组,g E抗体均为阴性;免疫21d时r PRV（FJ）-5D、PRV（FJ）-GM-CSF和r PRV（FJ）-CD40L组平均中和抗体效价分别为1:41.6、1:57.6和1:51.2,阴性对照组小于1:2。在攻毒后14d内,r PRV（FJ）-GM-CSF组、r PRV（FJ）-CD40L组g E抗体转阳速率低于r PRV（FJ）-5D组。各免疫组及阴性对照组所有仔猪无临床症状,免疫原性良好,而攻毒对照组仔猪在7d内全部死亡。排毒检测结果显示,r PRV（FJ）-GM-CSF、r PRV（FJ）-CD40L组较r PRV（FJ）-5D组可使仔猪排毒起始时间延后及缩短排毒持续期。综上,r PRV（FJ）-GM-CSF和r PRV（FJ）-CD40L株可作为疫苗候选株,作进一步研究。