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目的:1)诱导人脂肪干细胞(human adipose derived stem cells,hASCs)向平滑肌细胞分化并鉴定;2)探讨miR-145在hASCs向平滑肌细胞分化过程中的表达及作用;3)预测miR-145的作用靶基因,并确定miR-145及其靶基因对hASCs向平滑肌细胞分化过程中的作用机制;4)阐明钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶IIγ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IIγ,Ca MKIIγ)在hASCs向平滑肌细胞分化过程中的表达与作用机制。方法:1)分离培养人脂肪干细胞并鉴定;将第三代hASCs在转化生长因子β1(TGF-β1)和骨形态蛋白4(BMP4)的作用下向平滑肌细胞诱导分化,用荧光定量PCR、western blot、免疫荧光等方法检测平滑肌细胞特异性标记物的表达;2)hASCs向平滑肌细胞诱导7天以后检测miR-145的表达情况;合成miR-145模拟物及抑制物,并将其转染到hASCs,检测转染效率。转染成功以后进行诱导,观察平滑肌细胞特异性标记物的表达,并确定miR-145在这过程中的作用;3)利用生物学信息查询初步预测miR-145的靶基因,经过荧光素酶报告基因技术、miR-145的过表达及被抑制试验,确定miR-145与靶基因之间的作用关系;检测靶基因在hASCs向平滑肌诱导时的表达;合成miR-145的靶基因的si RNA干扰载体并转染到hASCs,检测转染效率。转染成功后向平滑肌细胞诱导并检测平滑肌细胞特异性标记物的表达;4)hASCs向平滑肌细胞诱导后检测Ca MKIIγ表达。合成Ca MKIIγ的过表达载体及沉默载体转染到hASCs,检测转染效率。转染成功后进行诱导并利用荧光定量PCR、western blot、免疫荧光等方法检测平滑肌细胞特异性标记物的表达,确定Ca MKIIγ对hASCs向平滑肌细胞分化中的作用机制。结果:1)第三代hASCs在倒置显微镜下表现为细长成纤维样形态,CD13、CD34、CD44、CD49d、CD90、CD105以及CD166阳性表达,而造血细胞与内皮细胞表达的CD14、CD45与CD31阴性表达;hASCs向平滑肌细胞诱导7天后,具有平滑肌细胞特有的“波峰-波谷”样生长特点。表达平滑肌细胞特异性标记物:a-SMA,SM22a,calponin及SM-MHC;2)hASCs向平滑肌细胞诱导7天以后miR-145的表达逐渐增高。miR-145转染到细胞以后平滑肌细胞特异性标记物的表达明显增高,而miR-145被抑制以后结果相反;3)利用生物学信息查询及文献阅读,初步定KLF-4为miR-145在hASCs向平滑肌细胞分化中的靶基因,并被荧光素酶报告基因技术结果所确定。KLF-4在hASCs向平滑肌细胞诱导过程中表达逐渐下降。KLF-4被miR-145抑制,而miR-145被抑制以后KLF-4的表达增高。在hASCs向平滑肌细胞分化过程中抑制KLF-4导致平滑肌细胞特异性标记物的表达增高;4)在hASCs向平滑肌细胞分化过程中Ca MKIIγ的表达明显增高。Ca MKIIγ过表达使平滑肌细胞特异性标记物的表达增高,而沉默Ca MKIIγ使hASCs向平滑肌分化被抑制。结论:1)hASCs获取方便,在普通培养条件下生长良好,并能维持干细胞的特性,能作为组织工程研究及应用的首选种子细胞;2)TGF-β1和BMP4能使hASCs向平滑肌细胞分化;3)miR-145在hASCs向平滑肌细胞分化过程中起正调控作用,这个作用是经过抑制KLF-4完成;4)Ca MKIIγ促进hASCs向平滑肌细胞分化。