神经病理性疼痛(Neuropathic Pain,NPP)是由躯体感觉神经系统的损伤或疾病造成的一种慢性疼痛[1]。其表现为自发性疼痛、痛觉过敏、异常疼痛和感觉异常等临床特征[2]。许多疾病都能诱发神经病理性疼痛,例如糖尿病、带状孢疹、麻风病、HIV感染以及神经根病变等。根据流行病学的研究,所有人群患有神经病理性疼痛的概率高达6.9%-10%[3]。由于造成神经病理性疼痛的因素种类繁多,因此其发生机制还不够确切。目前关于神经病理性疼痛发生机制的研究主要集中在离子通道的改变、二阶疼痛相关神经元功能的改变以及抑制性中间神经元功能的改变。超极化激活的环腺苷酸门控通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels,HCN)属于电压门控通道,有HCN1-4四个亚型。HCN通道只有在膜电位超极化时才被激活,进而向内产生一种兴奋性电流,称为Ih电流。Ih电流参与多种神经活动,包括控制静息膜电位,诱发神经振荡,调节神经递质的释放等[4]。研究显示,HCN通道广泛分布于痛觉传导通路并在疼痛形成和发展过程中发挥了至关重要的作用[5]。炎性介质PEG2可以加强HCN2的缺失对小的感觉神经元动作电位的影响,而这些小的感觉神经元中绝大部分都属于痛觉感受器,这就说明HCN2在炎性疼痛中起着重要的作用。与此同时,神经病理性疼痛会因为腺苷酸环化酶缺失、COX2受抑制、m PGES-1缺失得到缓解,而后两者参与PEG2的合成[6]。以上研究结果示我们HCN2通道在参与炎性疼痛的同时还极有可能参与了神经病理性疼痛。因此,本实验拟采用脊神经结扎损伤(SNL)这一经典的神经痛模型来证实HCN2是否参与了外周神经病理性疼痛,并尽可能在此基础上研究其机制。第一部分HCN2参与外周神经病理性疼痛的初步研究目的:利用大鼠脊神经结扎神经痛模型,研究HCN2是否参与了外周神经病理性疼痛。内容:1.比较不同手术方法下大鼠脊神经结扎模型的造模效果,并对最佳的造模方法进行造模评价。2.通过药理学方法检测HCN2的非特异性抑制剂ZD7288是否有逆转疼痛的效果。从而间接证明HCN2是否参与了外周神经病理性疼痛。3.采用q PCR的方法检测神经痛模型大鼠DRG内HCN2 m RNA的表达变化情况。4.采用Western blot的方法检测神经痛模型大鼠DRG内HCN2通道蛋白的表达变化情况。方法:1.采用三种手术方法建立神经痛模型:Sham组,将大鼠L4、L5脊神经分离后,不作处理,直接缝合伤口;SNL组,用丝线结扎L5脊神经,L4脊神经不作处理;m SNL组,用丝线结扎L5脊神经,用铬制羊肠线在L4脊神经上做轻度结扎;SNA组,用丝线结扎L5脊神经,并将结扎处DRG的远侧端剪断,再用铬制羊肠线在L4脊神经上做轻度结扎。手术一周后对大鼠进行行为学评价。2.将造模成功后的大鼠进行随机分组(n=6),按如下方法进行给药试验:阴性对照组(Saline),足底注射0.9%生理盐水,注射剂量为500μl/kg;阳性对照组(GBPT),腹腔注射0.9%生理盐水配制的加巴喷丁溶液,注射剂量为10mg/kg;治疗组(ZD7288),足底注射0.9%生理盐水配制的ZD7288溶液,注射剂量为15μg/kg。分别在给药前和给药后1h、4h、24h、48h五个时间点对大鼠进行机械痛实验、热板实验、自发抬足实验。3.获取神经痛模型大鼠的DRG,取总RNA,再逆转录得到c DNA,然后进行实时荧光定量PCR检测HCN2 m RNA的变化情况。4.获取神经痛模型大鼠的DRG,取蛋白质,用Western blot的方法检测HCN2通道蛋白的变化情况。结果:1.行为学的实验结果显示,本实验建立的大鼠脊神经结扎神经痛模型能达到实验要求。2.机械痛实验、热板实验和自发抬足实验发现,对比生理盐水组,阳性对照组GBPT和ZD7288治疗组均能明显的减轻大鼠神经病理性疼痛的症状。3.q PCR以及Western blot的结果均显示,对比正常大鼠,大鼠DRG内的HCN2表达上调。结论:HCN2参与了神经病理性疼痛的发生,研究其机制将为治疗神经病理性疼痛供理论基础。第二部分HCN2条件敲除小鼠的建立及表型分析目的:建立HCN2条件敲除小鼠,为HCN2参与外周神经病理性疼痛的机制研究供手段。内容:1.根据Cre/Lox P重组酶系统的原理,利用hcn2基因的flox纯合小鼠与NSE-Cre小鼠进行两轮杂交,得到HCN2的条件敲除小鼠。2.通过生长繁殖情况、行为学检测对HCN2条件敲除小鼠进行基本的表型分析。方法:1.用hcn2flox/+杂合子小鼠自交得到hcn2flox/flox,再用hcn2flox/flox与NSE-Cre小鼠杂交得到hcn2flox/+·cre+,然后用hcn2flox/flox与hcn2flox/+·cre+杂交得到hcn2flox/flox·cre+纯合子小鼠。采用取鼠尾DNA进行PCR的方法鉴定小鼠的基因型。2.利用免疫荧光的方法检测HCN2的敲除情况。3.对比正常小鼠和HCN2条件敲除小鼠的外观、体重等对敲除小鼠的生长发育能力进行评价。4.利用旷场实验、足迹实验、滚轴实验对HCN2敲除小鼠的行为能力进行评价。5.利用热板实验对HCN2敲除小鼠进行痛觉方面的评价。结果:1.成功繁育出hcn2flox/flox·cre+纯合子小鼠。2.免疫荧光实验结果证明HCN2敲除小鼠体内的HCN2被部分敲除。3.HCN2条件敲除小鼠的生长发育、繁殖能力和正常小鼠无明显差异。4.行为学实验结果显示HCN2条件敲除小鼠的行为能力和正常小鼠无明显差异。5.热板实验结果显示HCN2条件敲除小鼠在热痛方面和正常小鼠无明显差异。结论:本研究成功建立了HCN2条件敲除小鼠。但是HCN2在该小鼠体内只有部分被敲除,其原因有待分析。虽然HCN2的敲除效果没有达到我们的预期,但该小鼠仍然有一定的利用价值,可用于神经病理性疼痛的研究。