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目的:天然胶原蛋白是结缔组织的主要成分之一,具有良好的生物相容性,但胶原存在加工性差、缺乏柔韧性、抗拉力差等缺点,单独用做修复软骨缺损的载体材料难以达到要求。软骨细胞外基质(ECM)富含蛋白聚糖、糖胺聚糖、Ⅱ型胶原蛋白及其它成分。关节软骨依靠大量的自分泌因子维持软骨细胞的表型和正常基质的代谢。生长因子可调节软骨细胞增殖、分化及代谢功能,并参与了关节软骨的生理及病理过程。本课题拟用牛真皮为原料,制备脱细胞真皮基质胶原膜(ADM),并在此基础上进一步应用硫酸软骨素(CS)、透明质酸钠(HA)、Ⅱ型胶原(Col-Ⅱ)、转化生长因子-β(TGF-β)和胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)等修饰ADM,以便最大程度上模拟软骨细胞的生长环境,促进软骨细胞更好的增长,更好的用于软骨缺损的治疗。方法:采用积水潭医院创伤骨科研究所提供的技术方法制备ADM。消毒包装后备用。取新生新西兰胎兔4只,行软骨细胞分离,原代培养,传代培养。绘制生长曲线,行HE及双醋酸荧光素(FDA)-碘化丙啶(PI)荧光染色。分为空白组、CS组、HA组、Col-Ⅱ组、TGF-β组、IGF-I组、混合组。配制0.5%(m/v)的CS高糖DMEM溶液;1.0%(m/v)的HA高糖DMEM溶液;0.5%(m/v)Col-Ⅱ高糖DMEM溶液;1ng/ml的TGF-β高糖DMEM溶液;10ng/ml的IGF-I高糖DMEM溶液;将上述五种修饰材料配成0.5%的CS+1.0%的HA+0.5%Col-Ⅱ+1ng/ml的TGF-β+10ng/ml的IGF-I高糖DMEM混合溶液。共6组溶液与ADM的复合。消毒包装后备用。软骨细胞体外培养至第3代,制成浓度为5×106/ml的软骨细胞悬液。与备用的7组ADM复合培养。于1、3、7、14、21天行扫描电镜观察,包埋切片,HE染色,S100免疫组化染色。免疫组化结果行阳性细胞计数。于1、3、7天时,取复合软骨细胞的ADM,行RT-PCR。BanScan4.3凝胶图像分析软件,分析所得结果。制作兔膝关节软骨缺损模型,分为3组,混合修复组植入物为多种材料修饰ADM复合软骨细胞,单纯胶原膜组植入物为未修饰的ADM复合软骨细胞,空白对照组不复合任何材料。分别于第1、2、3月取材行大体观察、HE染色、Col-Ⅱ免疫组化染色,并用Wakitani法进行组织学评分。结果:制备所得的ADM外观呈白色,具有弹性。电镜下可见呈多孔疏松结构,孔隙率较佳,适合软骨细胞生长。关节软骨经Ⅱ型胶原酶消化2～4小时后离心去上清液,加入培养液进行原代细胞培养,并能通过传代增殖获得大量软骨细胞。HE染色示细胞形态较好,FDA-PI荧光染色示细胞活性率达98%以上。电镜结果显示各组修饰效果:混合组>Col-Ⅱ>TGF-β>CS>HA及IGF-Ⅰ。HE及免疫组化结果示:混合修饰组细胞形态最佳,阳性率最高。显微镜下对阳性细胞数进行计数,统计结果表明:修饰效果同电镜结果,混合组效果最佳。RT-PCR结果示,第1天时,Col-Ⅱ组,TGF-β组及混合组扩增出的条带明显。其余各组未见明显的扩增条带。第3,7天Col-Ⅱ组及混合组扩增出的条带明显。BanScan4.3凝胶图像分析软件分析结果显示混合组Col-ⅡmRNA的表达最高。大体观察及HE染色显示:第1、2、3月时混合修复组修复为透明软骨样修复,单纯材料组和空白对照组为纤维软骨及纤维性修复。Col-Ⅱ免疫组化结果显示:混合修复组阳性表达>单纯胶原膜组强>空白对照组。Wakitani组织学评分结果显示:混合修复组修复结果明显优于单纯材料组及空白对照组。结论:ADM具有良好的生物相容性;适宜的生物降解性;较好的细胞黏附表面活性;良好的可塑性;良好的三维多孔结构。混合修饰的ADM与软骨细胞有较好的相容性。混合修饰的ADM最适宜作为修复软骨缺损的载体。其修复关节软骨缺损的效果较佳。