嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus,A.caldus)具有高效硫氧化能力和对极端环境(低pH、高浓度金属离子)的适应能力,在生物浸出和生物修复领域存在广泛的应用前景和巨大的工业应用价值,受到人们的广泛关注。根据目前相关研究分析,影响A.caldus工业应用的主要因素之一是在浸矿后期极低pH的生长环境会对其生理活性产生强烈的抑制作用,严重影响A.caldus的生长和繁殖。因此,研究A.caldus与极端酸性生态系统之间的相互作用关系,阐明A.caldus适应低pH的机制及抗酸模式,对于理解和完善A.caldus的环境适应性及其生态行为具有重要的理论意义与实际应用价值。嗜酸菌的抗酸模式与中性菌的抗酸模式相比既有相同的抗酸系统又有其独特的抗酸机制。本实验室前期研究发现,在酸刺激(pH=0.5)条件下,A.caldus中铁吸收调节蛋白(ferric uptakeregulator,Fur)的转录水平上调了大约3倍,这暗示了 Fur蛋白在A.caldus的酸耐受响应中发挥一定的作用。基于实验室前期研究基础及文献报道,本论文从以下三个方面开展了A.caldus中Fur蛋白的研究工作。第一,首次开发并利用萤火虫荧光素酶报告系统原位研究了A.caldus在酸刺激时Fur蛋白的表达水平,结果表明在酸刺激过程中荧光强度急剧上升;酸刺激条件下对A.caldus生长曲线的分析,表明fur基因缺失导致了A.caldus表现出酸敏感的表型特征,回补和过表达菌株的生长曲线分析也表现出相应的酸抗性表型特征。通过上述实验揭示了A.caldus在酸胁迫时fur基因响应并参与A.caldus的极端酸抗性。第二,首先对酸刺激条件下野生型(WT)与突变株(Δfur)的转录组数据进行分析。与WT菌株相比,共有302个基因在Δfur中差异表达,其中包括214个上调基因和88个下调基因。差异表达基因(DEGs)KEGG富集表明一些生理代谢途径受A.caldus中fur基因缺失的影响,这些途径包括细菌趋化性、鞭毛组装、硫代谢、氮代谢和双组分系统等,转录组数据暗示了 Fur蛋白在酸刺激条件下通过调节部分基因的表达水平进而影响细胞的生理行为。其次,首次设计并测试了DNA pull-down seq实验即体外研究了 Fur蛋白在A.caldus中的直接作用位点,再结合转录组重构A.caldus中基于Fur蛋白的耐酸调控网络,初步验证了DNA pull-down seq实验方案的可行性,这为后期实验的顺利实施奠定了坚实的基础。最后,从转录组数据中发掘出部分受Fur蛋白调控的基因,并通过EMSA、RT-qPCR及结晶紫生物膜染色等实验验证了相关抗酸系统基因的功能及表型,如受Fur直接调控的铁转运、间接调控的Pel系统等。第三,利用生物信息学技术分析了 Fur蛋白在嗜酸菌中的分布及氨基酸序列的保守性。结果表明,Fur蛋白广泛分布在嗜酸菌中且氨基酸序列高度保守。同时预测并鉴定了A.caldus中Fur蛋白的关键(金属)调控位点,进一步通过Fur蛋白异源表达及纯化、EMSA、突变体基因敲入、RT-qPCR及生长表型分析等实验初步确定了铁转运与酸抗性之间的关系,并分别在体内和体外研究了 Fur可能参与的调控基因。综上所述,通过酸刺激条件下荧光强度的检测及表型表征分析,发现了 Fur在A.caldus响应并适应酸性环境中的重要性。由生物信息学分析发现Fur在嗜酸菌中普遍存在且氨基酸序列高度保守,通过多序列比对、定点诱变和生化分析鉴定了 Fur蛋白的关键调控位点及其与酸耐受性之间的关系。RNA-seq及DNA pull-down seq数据表明,Fur通过调节细胞生理活动的一些关键基因的表达从而参与A.caldus的极端耐酸性,例如铁转运、生物膜形成、硫代谢、细菌趋化性和鞭毛生物合成,并由此提出了A.caldus中基于Fur蛋白的抗酸调节策略,以阐释低pH条件下A.caldus的生态行为。本项研究为嗜酸菌适应酸性生态系统提供了新的见解,Fur蛋白的功能研究将会促进嗜酸菌在环境适应性工程生物系统中的设计和开发。