酚酸与卵白蛋白的相互作用及改性卵白蛋白在构建运载体中的应用

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酚酸是一种植物活性成分,在蔬菜和水果中含量较多,因具有对人体有益的生物活性而备受关注。但是酚酸的水溶性和稳定性差,而且环境不利因素也会对其生物活性造成较大影响,所以提高酚酸的稳定性和生物利用率是亟待解决的课题。纳米递送体系是一种保护药物或者食品功能因子的有效方法,在国内外已经有较多的研究。蛋清中54%的蛋白质是卵白蛋白,因其在日常生活中使用频率高,且营养丰富,已经成为物理化学研究的模型蛋白,经常被用作构建运载体系的原料。另外,蛋白质功能性质的好坏会影响纳米运载体系的稳定性,而糖基化改性是一种被证明可以改善蛋白质功能特性的方法。目前利用糖基化改性的蛋白质构建运载体系的研究鲜有报道。本研究选取了两种典型的植物酚酸化合物咖啡酸和阿魏酸为研究对象,联合多种光谱学方法并结合计算机模拟技术,研究它们与卵白蛋白的相互作用并探讨其结合机制。采用超声辅助糖基化改性卵白蛋白,改善卵白蛋白的功能性质,并利用这种改性的卵白蛋白构建阿魏酸纳米递送体系,探究改性的卵白蛋白对阿魏酸的包载作用和体外消化累计释放率的影响。主要研究结果如下:1.研究了两种酚酸(阿魏酸和咖啡酸)与卵白蛋白的相互作用,发现两种酚酸均能猝灭卵白蛋白的内源荧光。25℃时阿魏酸和咖啡酸与卵白蛋白的结合常数分别为1.69×10~4L mol-1和5.25×10~4L mol-1,表明阿魏酸和咖啡酸与卵白蛋白具有中等强度的亲和力。两种酚酸在卵白蛋白上均有一个结合位点,相互作用的主要驱动力是氢键和范德华力。阿魏酸或咖啡酸的存在对卵白蛋白的酪氨酸和色氨酸残基的疏水微环境并无显著影响。同步荧光猝灭比表明,酪氨酸残基更接近两种酚酸结合卵白蛋白的位点,相同浓度下的咖啡酸对卵白蛋白构象的影响比阿魏酸更大。另外,阿魏酸、咖啡酸的结合诱导卵白蛋白的α-螺旋含量降低,β-折叠含量增加,导致卵白蛋白的结构变得松散。分子模拟显示,阿魏酸和咖啡酸均对接于卵白蛋白的疏水性空腔中,阿魏酸与卵白蛋白的Arg84,Asn88,Leu101和Ser103残基形成氢键,而咖啡酸与卵白蛋白的Arg84,Leu101和Ser103残基形成氢键。分子动力学模拟结果表明,阿魏酸比咖啡酸更能增强卵白蛋白的蛋白质碳骨架的稳定性,卵白蛋白的溶剂可及表面积在咖啡酸、阿魏酸结合前后没有明显变化,氢键在相互作用的过程中对稳定复合物起关键作用。2.比较了有无超声预处理对卵白蛋白糖基化的影响,并探究了超声辅助糖基化改性对卵白蛋白的结构和功能性质的影响。结果发现超声可以提高接枝度,加快卵白蛋白的糖基化进程。经过糖基化或超声糖基化改性的卵白蛋白,其内源荧光强度均降低。圆二色光谱分析表明,糖基化或超声糖基化会增加卵白蛋白的α-螺旋含量增加,致使卵白蛋白的结构更加致密。此外,糖基化和超声辅助糖基化这两种方法处理的卵白蛋白的表面疏水性降低,游离巯基的含量上升。经过糖基化和超声糖基化改性后,卵白蛋白的变性温度比天然状态时提高了9-10℃,卵白蛋白的热稳定性增强。改性后的卵白蛋白的乳化性能、抗氧化性都有很大的改善。其中,经过超声糖基化改性的卵白蛋白的乳化活性提高了47.63%,乳化稳定性提高了5.17%。超声的空化作用和糖基化高级产物的生成是这些理化性质和功能性质改善的主要原因。3.研究了利用改性后的卵白蛋白制备递送体系运载阿魏酸及其体外消化。以粒径和多分散性指数为测量指标,对改性卵白蛋白制备纳米颗粒体系的p H(3、4、5、6、7、8、9)、温度(70、80、90、100℃)、蛋白浓度(1、2、3、4、5、6 mg m L-1)三个条件进行优化,获得最佳的制备条件:温度为90℃,p H为6,蛋白浓度为4 mg m L-1。在最佳的制备条件下制备负载阿魏酸的纳米颗粒,得到当卵白蛋白和阿魏酸的质量比为10:1时,超声辅助糖基化改性的卵白蛋白制备的载药纳米颗粒的包埋率和荷载能力分别为69.87%和22.40%。扫描电镜显示超声辅助糖基化制备的纳米颗粒具有稳定的微观形态。体外消化实验结果表明,改性卵白蛋白制备的纳米颗粒能够显著地增加阿魏酸的稳定性,有效控制阿魏酸在肠道中释放。
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