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研究背景及目的:非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌最常见的组织学亚型,占所有肺癌病例的85%以上,晚期NSCLC的预后差。具有表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突变的NSCLC患者对相应的分子靶向药物,即酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKIs）,治疗反应良好,不良反应小。但由于获得性耐药,几乎所有经过靶向治疗的EGFR基因突变NSCLC都会不可避免地发生进展。对于TKIs耐药导致疾病进展的NSCLC,目前进一步的治疗策略有限。近年来,免疫治疗已成为无驱动基因突变NSCLC患者的一线治疗策略,不良反应小,极大地改善了患者的生活质量并提高了患者的生存期。然而,对于携带靶向基因突变的患者,包括EGFR基因突变NSCLC患者,对抗程序性死亡蛋白-1（Programmed cell death protein 1,PD-1）及其配体1（Programmed cell death ligand 1,PD-L1）免疫治疗反应较差。介导EGFR基因突变肺腺癌患者免疫治疗疗效较差的机制尚不清楚。因此,深入研究EGFR基因突变肺腺癌及TKIs耐药NSCLC对免疫治疗的抵抗机制,有望为改善免疫治疗疗效提供新思路。Hippo通路效应因子Yes-associated protein（YAP）在多种癌症中起致癌基因的作用。Hippo通路打开时,YAP磷酸化并滞留于细胞质内,当Hippo通路关闭时,YAP被转运至细胞核内与TEAD（Transcriptional enhanced associate domain）形成转录复合物,调控许多基因的转录,在细胞增殖,凋亡抑制等通路中发挥作用。越来越多的研究表明Hippo/YAP通路可以调节免疫系统。在前列腺癌研究中有显示YAP可能通过调节骨髓源性抑制细胞（Myeloid derived suppressor cells,MDSCs）浸润而导致癌症进展和免疫治疗的耐药性。同时抑制YAP可能抑制MDSCs的招募,从而激活效应T细胞活性来增强肿瘤对免疫药物的敏感性。越来越多的证据表明,MDSCs在各种实体肿瘤患者中代表了一种真正的免疫抑制细胞群。虽然还需要进一步的机制探索和临床前研究,联合应用YAP抑制剂和免疫治疗药物有可能成为一种新的治疗策略。目前,尚无YAP在肺腺癌中调节MDSCs迁移的相关研究,因此,我们设计该课题探讨EGFR基因突变肺腺癌中YAP通路对MDSCs迁移的影响及内在机制。实验方法:采用蛋白质组学技术对EGFR基因突变吉非替尼敏感和耐药肺腺癌患者胸腔积液进行了蛋白质组学分析鉴定;应用UALCAN及GEPIA数据库分析YAP和CXCL5在肺腺癌中表达的相关性分析及其与患者预后之间的相关性。回顾性分析了192例EGFR基因突变的肺腺癌及60例无驱动基因突变的肺腺癌。通过免疫组织化学方法分析肿瘤组织中YAP和CXCL5的表达及其与EGFR基因突变肺腺癌临床病理学特征和预后的相关性。评估肿瘤内CD33+MDSCs及CD8+T细胞的浸润情况,探讨YAP表达与肿瘤组织内浸润的MDSCs及CD8+T细胞的关系。采用PD-L1 IHC 22C3 pharm Dx抗体评估肿瘤PD-L1表达情况。体外细胞实验中,通过免疫印迹法（Western blot）、ELISA及RT-q PCR方法检测人NSCLC细胞株A549和H1299以及人肺腺癌吉非替尼敏感性细胞株PC9和获得性吉非替尼耐药细胞株PC9/GR中YAP及CXCL5的表达情况。同时分离人外周血单个核细胞,磁珠分选获得CD33+和CD8+T细胞,通过共培养模型的建立,验证PC9细胞中YAP的不同表达情况对MDSCs迁移的影响,并检测MDSCs对CD8+T细胞增殖的抑制作用。染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,Ch IP）及双荧光素酶报告基因实验用于检测YAP与CXCL5启动子区域结合情况。结果:1.蛋白质谱分析发现YAP、CXCR2、CXCL5蛋白在吉非替尼敏感和耐药患者中具有明显的差异且与细胞中许多重要功能相关。2.UALCAN及GEPIA数据库分析结果显示YAP m RNA高表达肺腺癌患者预后差,而CXCL5 m RNA表达与患者预后无明显相关性;YAP表达与CXCL5表达呈正相关。3.肺腺癌组织免疫组织化学结果显示,YAP蛋白细胞浆表达在EGFR基因突变和无驱动基因突变肿瘤细胞中的高表达率分别为62.0%和48.3%,差异无统计学意义（P=0.072）,YAP蛋白细胞核高表达率分别为47.9%和26.7%,差异有统计学意义（P=0.004）。CXCL5着色定位于肿瘤细胞浆,CXCL5在两组中的高表达率分别为51.0%和31.7%,差异有统计学意义（P=0.009）。肿瘤浸润炎细胞内,MDSCs在两组中的高浸润率分别为35.4%和18.3%,有显著差异（P=0.013）;CD8的高浸润率分别为44.3%和63.3%,差异有统计学意义（P=0.01）。4.EGFR基因突变肺腺癌中,临床病理学分析发现,YAP蛋白细胞核表达与组织学分级（P=0.016）、病理TNM分期（P＜0.001）和肿瘤直径（P=0.001）呈正相关;YAP蛋白细胞浆表达与各临床病理学特征间未见相关性;CXCL5表达与TNM分期呈正相关（P=0.001）。5.单因素分析结果显示,肿瘤直径＞3cm（P＜0.001）、组织学分化低（P＜0.001）、有淋巴结转移（P=0.001）、分期III-IV（P＜0.001）、YAP蛋白细胞核高表达（P＜0.001）、CXCL5高表达（P＜0.001）和MDSCs高浸润（P＜0.001）与总生存期（Over survival,OS）缩短相关,CD8高浸润（P=0.009）与OS延长相关。YAP蛋白细胞核高表达（P＜0.001）、CXCL5高表达（P=0.019）、MDSCs高浸润（P=0.001）、肿瘤直径＞3cm（P=0.001）、有淋巴结转移（P=0.013）和分期III-IV（P＜0.001）与无进展生存期（Disease-free survival,DFS）缩短相关。多因素分析结果显示,肿瘤直径＞3cm（P＜0.001）、YAP蛋白细胞核高表达（P=0.036）和CXCL5高表达（P=0.003）是患者OS的独立预后因素。YAP蛋白细胞核高表达（P=0.004）是患者DFS的独立预后因素。6.EGFR基因突变肺腺癌组织中,肿瘤浸润炎细胞内CD33+MDSCs和CD8+T细胞浸润情况及其与YAP和CXCL5表达之间的相关性分析结果显示,肿瘤内浸润的CD33+MDSCs数量与CD8+T淋巴细胞数量呈负相关（R=-0.309,P=0.005）,肿瘤内浸润的CD33+MDSCs数量与肿瘤细胞CXCL5蛋白表达呈显著正相关（R=0.355,P=0.002）,YAP蛋白细胞核表达与CXCL5表达呈正相关（R=0.376,P=0.001）。7.肺腺癌中PD-L1表达与YAP蛋白细胞核表达（P=0.001）呈正相关,与EGFR基因变异情况（P=0.916）不相关。8.YAP细胞核蛋白表达量在PC9细胞中高于H1299和A549细胞,P＜0.01,PC9/GR高于PC9,P＜0.05。9.PC9细胞中CXCL5蛋白和m RNA水平高于H1299和A549,P＜0.01。PC9/GR细胞中CXCL5蛋白和m RNA水平高于PC9,P＜0.01。10.si RNA敲低YAP降低PC9/GR细胞中CXCL5蛋白的表达量和CXCL5m RNA的表达量,P＜0.001。过表达YAP可显著提高PC9细胞中CXCL5蛋白和CXCL5 m RNA的表达量,P＜0.01。11.PC9与MDSCs细胞体外共培养实验结果显示CXCL5/CXCR2通路促进MDSCs迁移,阻断该通路显著减少MDSCs迁移;YAP通过调控CXCL5表达影响MDSCs的迁移。肿瘤相关MDSCs和T细胞共培养,T细胞增殖受到显著抑制。12.通过JASPAR数据库分析,在CXCL5基因的启动子区域发现了YAP/TEADs的结合位点。双荧光素酶报告基因实验验证了YAP/TEADs通过作用于CXCL5的启动子促进其转录。通过Ch IP实验进一步证实YAP/TEADs复合物直接作用于CXCL5启动子区域。结论:1.EGFR基因突变肺腺癌组织中细胞核YAP蛋白及CXCL5高表达,CXCL5表达水平与YAP蛋白细胞核表达呈正相关。YAP蛋白细胞核和CXCL5高表达是患者OS的独立预后因素。YAP蛋白细胞核高表达是患者DFS的独立预后因素。2.EGFR基因突变和EGFR基因突变吉非替尼耐药肺腺癌细胞株中YAP蛋白高表达,CXCL5蛋白水平增高。YAP能直接靶向结合CXCL5启动子区域并促进CXCL5转录。阻断CXCL5/CXCR2信号通路可显著减少MDSCs迁移。YAP通过CXCL5/CXCR2信号通路介导MDSCs迁移致T细胞增殖受抑制。