研究背景子痫前期(PE)是妊娠期特有的疾病,临床上以妊娠20周以后出现高血压、蛋白尿为特征,在全球范围内妊娠妇女的发病率约为2%～8%。子痫前期对母儿的危害均较大,是孕产妇及围产儿死亡率增高的主要原因之一,因此能够尽早诊断和有效治疗非常重要。子痫前期的发病机制颇为复杂,至今尚未完全阐明,目前以“子宫螺旋小动脉重铸不良、胎盘浅着床学说”最为学界所认可。该学说认为,子痫前期患者胎盘形成的早期,滋养细胞增殖及分化异常,伴凋亡过多,引起滋养细胞浸润能力下降、侵入子宫壁受限,进而引起子宫螺旋小动脉重铸不良及胎盘着床过浅,出现胎盘低血流量从而导致子痫前期的发病。妊娠的成功维持有赖于多个基因及信号转导通路的参与,越来越多的研究发现,在胎盘形成及发育过程中Wnt信号通路扮演着重要角色。Wnt2基因是Wnt基因家族的重要成员,是被识别的第二个Wnt基因。动物实验研究发现,将小鼠的Wnt2基因靶向破坏,其子代的出生体重下降,且半数于围产期死亡。另外,Wnt2基因突变导致胎儿毛细血管减少、纤维质沉积增加,并导致胎盘血管生成缺陷相关的胎盘异常。表观遗传学修饰通过改变基因组DNA对转录因子的可访问性,从而影响基因的活动。胎盘的表观遗传学调控指的是,在不改变DNA核苷酸序列的前提下,通过DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA调控等方式来调控基因的表达,从而影响胎盘中相应蛋白的合成,以调节胎盘的发育。DNA甲基化是研究最广泛、特征最明显的表观遗传学修饰模式,人类胎盘中异常的表观遗传模式,尤其是易感基因启动子区的DNA甲基化状态的改变,与多种妊娠相关并发症的病理生理学有关。动物实验研究结果显示,双酚A导致小鼠胎盘Wnt2基因启动子区的DNA甲基化程度增加,引起Wnt2表达下调,引发小鼠出现子痫前期样综合征。我们推测在人类子痫前期的发病过程中,Wnt2基因的表观遗传学调控异常导致基因表达的变化,进而影响滋养细胞的生物学行为,可能参与了子痫前期的发病机制。本研究旨在通过对胎盘组织中Wnt2基因的表达及调控机制的研究,探讨Wnt2基因在子痫前期发病的分子机制中的发挥的可能作用,为子痫前期的临床诊断和治疗提供新的理论依据。第一部分 Wnt2基因在子痫前期患者胎盘组织中的表达的研究研究目的:研究早发型重度子痫前期患者、晚发型重度子痫前期患者及正常晚期妊娠妇女胎盘组织中Wnt2基因mRNA及蛋白的表达,探讨Wnt2基因在子痫前期发病中的作用。研究方法:1.研究对象:选取2018年1月至2018年12月在滨州医学院附属医院产科病房经剖宫产分娩的早发型重度子痫前期患者30例作为早发型重度子痫前期组(ZPE),晚发型重度子痫前期患者30例作为晚发型重度子痫前期组(WPE),随机选取同期住院经剖宫产分娩的正常晚期妊娠妇女30例作为对照组(NC)。2.实验方法:采用qRT-PCR技术检测早发型重度子痫前期患者、晚发型重度子痫前期患者及正常晚期妊娠妇女胎盘组织中Wnt2 mRNA的表达,并采用Western blot技术及免疫组织化学技术检测Wnt2蛋白的表达。研究结果:1.早发型重度子痫前期组、晚发型重度子痫前期组和对照组三组之间比较,在山东大学博士学位论文平均年龄、体重指数、胎次方面差异均无统计学意义(P>0.05)。对照组与早发型重度子痫前期二组之间比较,在分娩孕周、收缩压、舒张压、尿蛋白量、新生儿出生体重及新生儿1min Apgar评分方面,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组与晚发型重度子痫前期组二组之间比较,在分娩孕周、收缩压、舒张压、尿蛋白量、新生儿出生体重及新生儿1min Apgar评分方面,差异均有统计学意义(P<0.05)。早发型重度子痫前期组与晚发型重度子痫前期组二组之间比较,在收缩压、舒张压、尿蛋白量方面,差异均无统计学意义(P>0.05);在分娩孕周、新生儿出生体重及新生儿1min Apgar评分方面,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.qRT-PCR检测结果显示早发型重度子痫前期组患者胎盘组织中Wnt2 mRNA的相对表达量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);晚发型重度子痫前期组患者胎盘组织中Wnt2 mRNA的相对表达量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);早发型重度子痫前期组患者胎盘组织中Wnt2 mRNA的相对表达量较晚发型重度子痫前期组低,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.Western blot检测结果显示,早发型重度子痫前期组患者胎盘组织中Wnt2蛋白的表达量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);晚发型重度子痫前期组患者胎盘组织中Wnt2蛋白的表达量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);早发型重度子痫前期组患者胎盘组织中Wnt2蛋白的表达量较晚发型重度子痫前期组低,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.免疫组织化学检测结果显示,Wnt2蛋白的主要表达部位为胎盘绒毛滋养细胞的细胞膜和细胞浆。早发型重度子痫前期组患者胎盘组织中Wnt2蛋白的表达量低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);晚发型重度子痫前期组患者胎盘组织中Wnt2蛋白的表达量较对照组低,差异具有统计学意义(P<0.05);免疫组织化学染色结果显示,早发型重度子痫前期组患者胎盘组织中Wnt2蛋白的表达量与晚发型重度子痫前期组之间差异无统计学意义(P>0.05)。研究结论:1.Wnt2基因mRNA及蛋白在正常晚期妊娠妇女及重度子痫前期患者胎盘组织中均有表达。2.Wnt2基因mRNA及蛋白的表达水平在正常晚期妊娠妇女胎盘组织中最高,其次为晚发型重度子痫前期患者,在早发型重度子痫前期患者胎盘组织中的表达水平最低。3.Wnt2蛋白的主要表达部位为胎盘绒毛滋养细胞的细胞膜和细胞浆。第二部分 Wnt2基因对人类滋养细胞生物学行为的影响研究目的:研究干扰和过表达Wnt2基因后各组滋养细胞生物学行为的变化并应用流式细胞术对细胞凋亡加以检测,从而了解Wnt2基因对滋养细胞生物学行为的影响,探讨Wnt2基因参与子痫前期发病的机制,为子痫前期的早期诊断和有效治疗提供新思路。研究方法:对HTR8细胞进行干扰(KD)和过表达(OE)Wnt2基因,采用CCK8细胞增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验及流式细胞术检测Wnt2基因KD组和Wnt2基因OE组HTR8细胞生物学行为(细胞增殖能力、细胞迁移能力、细胞侵袭能力、克隆形成能力和细胞凋亡)的差异。研究干扰Wnt2基因后细胞凋亡相关蛋白及细胞迁移和细胞侵袭相关蛋白的表达情况。研究结果:1.CCK8细胞增殖实验结果显示:干扰Wnt2基因后,KD组HTR8细胞增殖能力较NC组明显减弱(P<0.05);过表达Wnt2基因后,OE组HTR8细胞增殖能力较NC组明显增强(P<0.05),差异均具有统计学意义。2.平板克隆形成实验结果显示:在HTR8细胞中,干扰/过表达HTR8细胞中的Wnt2基因后,KD组与NC组相比,细胞克隆形成能力明显减弱(P<0.05);OE组与NC组相比,细胞克隆形成能力明显增强(P<0.05),差异均具有统计学意义。3.流式细胞术检测结果显示:干扰Wnt2后,HTR8细胞凋亡增加;过表达Wnt2后,与NC组相比,细胞凋亡受到抑制(P<0.05),差异均具有统计学意义。4.Transwell迁移实验结果显示:干扰/过表达HTR8细胞中的Wnt2基因后,KD组与NC组相比,细胞迁移能力明显减弱(P<0.05);OE组与NC组相比,细胞迁移能力明显增强(P<0.05),差异具有统计学意义。5.Transwell侵袭实验结果显示:干扰/过表达HTR8细胞中的Wnt2基因后,KD组与NC组相比,细胞侵袭能力明显减弱(P<0.05);OE组与NC组相比,细胞侵袭能力明显增强(P<0.05),差异具有统计学意义。6.细胞划痕实验结果显示:干扰/过表达Wnt2基因后,KD组和OE组HTR8细胞迁移能力较NC组分别减弱和增强,OE组细胞迁移能力明显高于NC组(P<0.05),差异具有统计学意义。7.干扰Wnt2基因后,HTR8细胞内促进凋亡的相关蛋白Cleaved-Caspases3及Bax表达增加,而抑制凋亡的相关蛋白Bcl-2表达减少;过表达Wnt2基因后,HTR8细胞内促进细胞凋亡的相关蛋白Cleaved-Caspases3及Bax表达减少,而抑制细胞凋亡的相关蛋白Bcl-2表达增加(P<0.05),差异均具有统计学意义。8.干扰Wnt2基因后,HTR8细胞内促进细胞迁移、侵袭的相关蛋白Vimentin、ββ-Catenin及N-cad表达减少,而抑制细胞迁移、侵袭的相关蛋白E-cad表达增加;过表达Wnt2基因后,HTR8细胞内促进细胞迁移、侵袭的相关蛋白Vimentin、ββ-Catenin及N-cad表达增加,而抑制细胞迁移、侵袭的相关蛋白E-cad表达减少(P<0.05),差异均具有统计学意义。研究结论:1.Wnt2基因对人类绒毛滋养细胞的增殖、迁移及克隆形成能力起促进作用,对滋养细胞的凋亡起抑制作用。2.Wnt2基因表达下调后影响滋养细胞生物学行为的可能机制为:Wnt2基因表达下调抑制经典的Wnt信号转导通路,从而导致滋养细胞的迁移及侵袭能力下降;Wnt2基因表达下调可促进Caspase介导的细胞凋亡,引起滋养细胞凋亡增多。3.Wnt2基因表达下调可能通过影响滋养细胞的生物学行为,进而导致胎盘形成缺陷及功能障碍,从而参与子痫前期的发病过程。第三部分 Wnt2基因的表观遗传学调控在子痫前期发病机制中的研究研究目的:分别检测早发型重度子痫前期患者、晚发型子痫前期患者及正常晚期妊娠妇女的胎盘组织中Wnt2基因启动子区的DNA甲基化程度,以探讨Wnt2表达下调诱发子痫前期的具体机制。研究方法:1.研究对象:选取2018年1月至2018年12月在滨州医学院附属医院产科病房经剖宫产分娩的早发型重度子痫前期患者30例作为早发型重度子痫前期组(ZPE),晚发型重度子痫前期患者30例作为晚发型重度子痫前期组(WPE),随机选取同期住院经剖宫产分娩的正常晚期妊娠妇女30例作为对照组(NC)。2.实验方法:采用甲基化特异性PCR技术检测早发型重度子痫前期患者、晚发型重度子痫前期患者及正常晚期妊娠妇女胎盘组织中Wnt2基因启动子区的DNA甲基化程度。研究结果:1.Wnt2基因在早发型重度子痫前期组,晚发型重度子痫前期组和对照组的胎盘组织中均为不完全甲基化。2.早发型重度子痫前期组患者胎盘组织中Wnt2基因启动子区的DNA甲基化程度高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);晚发型重度子痫前期组患者胎盘组织中Wnt2基因启动子区的DNA甲基化程度高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);而早发型重度子痫前期组和晚发型重度子痫前期组患者之间Wnt2基因启动子区的DNA甲基化程度差异无统计学意义(P>0.05)。研究结论:1.正常晚期妊娠妇女、早发型重度子痫前期及晚发型重度子痫前期患者的胎盘组织中,均存在Wnt2基因启动子区的DNA不完全甲基化。2.与正常晚期妊娠妇女相比,早发型重度子痫前期及晚发型重度子痫前期患者胎盘组织中Wnt2基因启动子区的DNA甲基化程度均明显增加。3.干预Wnt2基因启动子区的DNA甲基化状态可实现调节Wnt2基因表达的目的,Wnt2基因有望成为子痫前期早期诊断及有效治疗的新的理论切入点。