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研究目的:1、研究YAP1蛋白在临床三阴性乳腺癌紫杉醇耐药患者中表达情况,对比不同YAP1表达情况下患者生存预后分析;2、通过体外实验证实,YAP1抑制剂(维替泊芬)对于紫杉醇耐药三阴性乳腺癌细胞迁移、自噬及凋亡的影响,以及对于紫衫药物的增敏作用;3、通过体内实验证实,YAP1抑制剂(维替泊芬)能够部分逆转三阴性乳腺癌在裸鼠移植模型中紫杉醇的耐药作用。研究方法:1、通过The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库,分析乳腺癌组织中YAP1基因不同变化频率(扩增,突变,融合以及深度删除),应用免疫组织化学染色方法检测三阴性乳腺癌患者应用紫杉醇药物化疗后,药物抵抗患者组织中YAP1蛋白的表达水平及与临床相关性(包括三阴性乳腺组织中表达以及生存曲线分析);2、通过CCK-8法检测YAP1蛋白在MDA-MB-231以及MDA-MB-231紫杉醇耐药细胞株中对三阴性乳腺癌细胞系增殖的影响。利用RT-PCR、Western-blot法以及细胞免疫荧光法检测YAP1基因及蛋白在MDA-MB-231以及MDA-MB-231紫杉醇耐药细胞株中的表达情况;3、通过CCK-8法检测YAP1抑制剂(维替泊芬)在MDA-MB-231紫杉醇耐药细胞株中对细胞增殖的影响。应用划痕实验及Transwell实验检测维替泊芬对MDA-MB-231紫杉醇耐药细胞迁移和侵袭能力的影响。采用Western-blot法检测维替泊芬处理MDA-MB-231紫杉醇耐药细胞后E-cadherin,vimentin,SOX2CD44以及CD133等EMT通路及自噬相关蛋白水平变化;4、应用Annexin V/PI双染法(流式细胞仪)检测维替泊芬对三阴性乳腺癌紫杉醇耐药细胞凋亡的影响。并采用Western-blot法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl2以及BAX水平变化。5、通过建立BALB/c免疫缺陷小鼠三阴性乳腺癌移植瘤模型,通过荷瘤裸鼠瘤体大小、重量测量,检测维替泊芬对三阴性乳腺癌耐药的体内作用。应用免疫组化检测YAP1,Ki67以及E-cadherin相关蛋白表达。6、通过转染小干扰RNA下调基因YAP1的表达,再次检测细胞迁移、细胞自噬以及细胞凋亡在体内及体外实验中的变化影响。研究结果:1、基于临床数据库网站上乳腺癌患者的癌症基因组图谱数据(http://www.cbioportal.org)(TCGA,TCGA 2015,TCGA PanCan,TCGA Pub),在一部分乳腺癌患者中发现了YAP1基因的扩增和深度缺失。YAP1过表达与紫杉醇为基础化疗后TNBC患者早期复发相关(P=0.0119,Gehan-Breslow-Wilcoxon test)。RT-PCR分析显示TNBC患者的YAP1基因表达水平明显高于非TNBC患者(P<0.0001)。免疫组化结果显示与正常组织相比,三阴性乳腺癌患者标本中核YAP1染色增加(P<0.0001)。2、在体外实验中,我们首先建立MDA-MB-231 taxol耐药细胞系(耐药倍数为9.2倍),然后在接下来的体外实验中对该细胞系进行测试。我们检测三种乳腺癌细胞株(MCF7、MDA-MB-231和MDA-MB-231/taxol)中YAP1的RNA和蛋白水平。紫杉醇耐药细胞株中的YAP1蛋白过表达(P<0.0001),提示紫杉醇耐药的TNBC中YAP1蛋白表达上调。3、MDA-MB-231细胞的存活率高于MDA-MB-231/taxo耐药细胞株(P<0.0001)。在与紫杉醇、维替泊芬或维替泊芬与紫杉醇联合处理时,维替泊芬+紫杉醇处理细胞后发现MDA-MB-231细胞对迁移和存活的抑制程度较高。此外,维替泊芬处理或YAP1 siRNA处理后,细胞株的SOX2表达减少,CD44和CD133表达增强,以及Ecadherin和Vimentin的EMT相关通路蛋白改变。4、用YAP1抑制剂或YAP1 siRNA处理MDA-MB-231紫杉醇耐药细胞株,我们发现MDA-MB-231/taxo耐药细胞株的细胞凋亡率显著增高(P<0.0001)。此外,YAP1抑制剂治疗组中的细胞内Bcl2表达被抑制和Bax表达增加。5、体内实验结果显示,维替泊芬显著降低了小鼠紫杉醇耐药肿瘤的体积。此外,我们也观察到,当YAP1蛋白被敲除时,维替泊芬降低了Ki67蛋白表达并增加了Ecadherin的表达。研究结论:1、YAP1在三阴性乳腺癌患者中表达上调,并与紫杉醇治疗后早期复发有关。2、紫杉醇耐药的三阴性乳腺癌细胞中YAP1蛋白表达上调。3、YAP1抑制剂维替泊芬可能抑制三阴性乳腺癌细胞迁移、调节自噬或EMT相关通路。4、YAP1抑制剂维替泊芬在体外显著增强了紫杉醇治疗耐药TNBC的细胞凋亡。5、YAP1抑制剂维替泊芬逆转了体内TNBC肿瘤紫杉醇治疗的耐药性。