大黄始载于《神农本草经》,是临床上最常用的传统中药之一,具有广泛的药效作用,可用于泻下通便、活血化瘀、利尿、抗炎和抗肿瘤等。大黄作为影响全球的中药,在十九个国家的药典中都记载了其治疗便秘的药效,在目前的标准复方中成药中含有大黄并且应用其泻下作用的有120多种。由此可见,作为一种治疗便秘的临床用药,大黄疗效确切,作用显著。然而,近期临床研究发现,生大黄不仅仅具有“泻下”作用,也具有“收敛”作用。许多习惯性便秘的患者及盲目追求减肥的年轻女性,长期、大剂量服用含有生大黄的泻下药物,在初期产生良好的泻下作用后,用药后期则出现更为严重的便秘、甚至结肠黑变病等副作用,严重危害自身健康。药效作用或副作用的产生源于药物中的药效物质基础。生大黄的长期使用在临床上出现“先泻后敛”作用与其所含效应成分相关。课题组多年来对大黄不同炮制品的化学成分变化规律及其与药性变化的相关性进行了系统的研究,本课题在前期研究的基础上,以生大黄“先泻后敛”的作用现象为切入点,以药性缓和,泻下作用较弱的熟大黄为对照,通过比较大黄提取物及其蒽醌、鞣质组分服用不同周期的药效作用,探索其化学成分与药效的相关性,揭示生大黄“先泻后敛”作用的物质基础;基于LC-MS/MS代谢组学技术,系统比较正常动物及生大黄干预不同周期动物血浆中内源代谢物,解析从泻下到便秘过程中具有监控效力的生物标志物,探索生大黄“先泻后敛”效应机制,为合理指导大黄临床用药提供科学依据。一、生大黄中化学成分的定量表征利用UPLC-DAD分析方法,对生大黄提取物中12个化学成分进行定量分析,包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、没食子酸乙酯、莲花掌苷、异莲花掌苷、4’-羟基苯基-2-丁酮-4’-O-β-D-（2"-没食子酰基-6"-O-（4’"-羟基）-桂皮酰基）。结果显示,各成分在生大黄中的含量分别为0.05%、0.66%、0.19%、0.12%、0.36%、0.23%、1.81%、0.29%、0.99%、5.46%、7.73%、1.69%。为将熟大黄作为对照样品进行后续研究,同时进行了熟大黄中各成分的含量测定,结果显示各成分的含量分别为0.13%、1.29%、0.23%、0.21%、0.55%、0.18%、1.76%、0.14%、0.03%、2.49%、2.89%、0.12%。与生大黄相比,炮制后熟大黄中芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、4’-羟基苯基-2-丁酮-4’-O-β-D-（2"-没食子酰基-6"-O-（4’"-羟基）-桂皮酰基）、没食子酸乙酯、莲花掌苷、异莲花掌苷等蒽醌苷类、苯丁酮苷类成分含量降低,而芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等蒽醌苷元成分的含量升高。生大黄中各成分的定量表征研究为进一步阐明生大黄“先泻后敛”药效作用与相关物质基础提供了研究基础。二、生大黄提取物及其活性组分“先泻后敛”的药效作用研究以熟大黄提取物作为对照,对生大黄提取物“先泻后敛”的药效作用进行研究。对小鼠进行连续7天灌胃给药,分别于给药第一、三、七天取样,测定泻下指数（EI）,血清中的胃动素（MTL）、血管活性肠肽（VIP）、肾上腺素（EPI）三种肠道激素的水平变化以及观察小鼠结肠组织的病理变化,以阐明生大黄“先泻后敛”药效作用;同时,为探究生大黄“先泻后敛”作用的相关药效成分,进一步对生大黄中蒽醌、鞣质组分进行药效作用研究,测定泻下指数和三种肠道激素的水平变化。EI结果显示,生大黄给药第一天泻下作用十分显著,第三天泻下作用最强,第四天泻下作用减弱,第五天出现便秘现象,第六天和第七天便秘现象逐渐加重;生大黄蒽醌组分在给药前期并不能发挥显著的泻下作用,在第五天出现便秘现象,并且一直保持便秘的作用;生大黄鞣质组分在前期泻下作用逐渐增强,第三天时泻下作用最强,后期泻下作用逐渐减弱,并在第七天出现便秘现象。由此可得,生大黄“先泻后敛”作用明显,其中蒽醌及鞣质类组分是该作用的相关效应成分。生大黄中蒽醌苷与苷元的比例为4:1,高浓度的蒽醌苷抑制了肠道菌群活性,使蒽醌苷不能水解为苷元,因此不能有效发挥泻下作用。而生大黄中缩合鞣质在给药前期有强烈的泻下作用,但由于缩合鞣质会在肠道内水解为单体鞣质没食子酸,因此后期会产生“收敛”作用。生大黄中蒽醌和鞣质组分的存在,使生大黄具有“先泻后敛”的“错位效应”。体内激素水平测定结果表明,生大黄给药第一天可促进MTL分泌,降低VIP及EPI浓度,发挥泻下作用;给药第三天,虽抑制MTL分泌,但同时降低EPI浓度,能够发挥泻下作用;但给药第七天时,生大黄抑制MTL分泌作用增强,同时促进VIP及EPI浓度大量升高,发挥收敛作用,出现便秘现象。生大黄可能通过影响MTL、VIP和EPI等体内激素水平的变化来发挥其“先泻后敛”的药效作用。不同的用药时期可能会是不同的激素发挥主要作用,这些激素之间的共同作用促使生大黄发挥“先泻后敛”的药效作用。生大黄蒽醌组和鞣质组分研究结果显示,给药第一天,MTL含量均显著下降,与生大黄提取物作用相反,而对VIP和EPI的调节作用与提取物相同,为显著降低;给药第三天,蒽醌组MTL、EPI含量显著降低,鞣质组MTL、VIP含量显著升高;给药第七天蒽醌组MTL含量显著降低而VIP含量显著升高,蒽醌组和鞣质组EPI含量显著降低。与生大黄提取物相比,给药前期和中期,生大黄蒽醌组泻下作用不明显,可能是因为MTL含量下降,不能发挥强烈的泻下作用;给药第七天,出现便秘现象可能是因为VIP含量升高,收敛作用增强。生大黄鞣质组给药第三天,泻下作用最强可能是因为MTL含量升高。生大黄中蒽醌、鞣质类组分通过调节体内MTL、VIP和EPI等的激素水平,从而表现出前期和后期不同的药效作用。同时,小鼠结肠病理切片结果显示,生大黄长期给药不仅产生“收敛”作用,而且会使小鼠结肠内产生炎症。相关研究表明,便秘作用可能与炎症相关。三、基于代谢组学生大黄“先泻后敛”的作用机制研究本章利用高分离度和高灵敏度的UHPLC/MS方法,采用正相、反向色谱分离进行非靶向代谢组学分析方法,研究生大黄长期给药对小鼠血清内源性代谢产物的影响,探讨生大黄“先泻后敛”的作用机制。PCA图显示,生大黄组与空白对照组具有明显的分离趋势,说明生大黄给药能使小鼠体内代谢发生变化,内源性代谢物存在明显差异。采用OPLS-DA模型和独立样本t检验确定VIP＞1和P＜0.05的代谢物特征代谢物。分别与给药初期（第1天）、给药后期（第7天）筛选出63和55种差异代谢物,主要包括磷脂酰胆碱（PC）、溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）、氨基酸类和肉碱类,除此之外还有别嘌呤醇（Allopurinol）、次黄嘌呤（Hypoxanthine）、油酰胺（Oleamide）、鞘磷脂（SM）、和肌酸（Creatine）等。与空白对照组相比,大部分PC和LysoPC由第1天含量上调变为第7天含量下调。这种逆转调节作用可能与生大黄的“先泻后敛”作用相关。PC和LysoPC能够抑制炎症因子的上调,因此它们含量的下调可能会引发炎症,进而导致便秘。与空白对照组相比,L-精氨酸（L-arginine）由第一天含量下调变为第七天含量上调;第1天未检测到L-脯氨酸（L-proline）,而在第7天可检测到L-proline,并且呈现出上调趋势;第1天L-组氨酸（L-histidine）显著下调至第7天时未检测到;L-缬氨酸（L-valine）水平由第1天下调转变为第7天上调。这些氨基酸类代谢物在第一天和第七天出现的逆转调节可能通过各自的作用机制影响生大黄的药效作用,进而产生“先泻后敛”的作用现象。肉碱类成分中,第1天L-肉碱（L-carnitine）、L-乙酰肉碱（L-acetylcarnitine）以及其他酰基肉碱含量下调,第七天大多数肉碱都未检测到。研究报道,肉碱的缺乏可能与便秘以及炎症相关。此外,与空白对照组相比,别嘌呤醇和次黄嘌呤含量在第1天均上调,而在第7天则出现下调趋势。这些代谢物与结肠炎症相关,可能通过调节炎症通路引发生大黄的“收敛”作用。油酰胺在第1天未检测到,但在第7天可检测到油酰胺,推测油酰胺的产生可能是继发性便秘的原因之一。代谢组学研究结果显示,筛选出的差异性代谢物主要包括:磷脂如PC、LysoPC,氨基酸如L-精氨酸、L-脯氨酸、L-组氨酸、L-缬氨酸,肉碱如L-肉碱、L-酰基肉碱,以及其他小分子物质如别嘌呤醇、次黄嘌呤和油酰胺等。生大黄长期给药后出现“先泻后敛”药效作用的原因可能与这些差异性代谢物的代谢调节作用密切相关。同时代谢通路分析表明,磷脂生物合成,精氨酸、脯氨酸和组氨酸代谢等代谢通路可能与生大黄的泻下和收敛作用相关。此外,研究发现生大黄的“先泻后敛”药效作用可能与炎症通路相关,差异性代谢物可能通过直接或间接调节炎症信号、炎症分子进而产生便秘副作用。因此,生大黄在临床上作为泻下药物使用时,不宜长期使用。长期服用会引发肠道炎症,肠道机能受损,进而产生便秘的副作用。特别是脾胃气虚或阳虚者,应慎用。而熟大黄在给药期间一直发挥稳定、缓和的泻下作用,且无炎症出现。因此适应于治疗体虚气弱者的便秘,从而体现了炮制缓和大黄药性的作用意义。本论文的研究对于合理指导大黄的临床用药,避免其继发性便秘副作用具有重要意义。