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目的:临床上牙周疾病治疗的终极目标在于恢复牙周组织原有的结构和功能—即牙周组织再生,形成牙周新附着。尽管从猪的牙胚中提取的釉基质蛋白(Enamel matrix proteins,EMPs)已经用于了被病变破坏的牙周组织的修复,实现牙周组织的功能性重建,但商品化的EMPs仍存在获取来源限制,获取方法耗时耗力等诸多问题。近年来,有研究者们提出釉原蛋白(amelogenin,Am)是EMPs促进牙周组织再生的主要活性成分,有望代替EMPs用于牙周组织再生。因此,本实验通过基因工程技术构建原核和真核表达系统,分别在E.coli WK6、毕赤酵母GS115以及HEK 293F中表达并纯化出rhAm,将hPDLFs与HS-5作为靶细胞,初步探究不同来源的rhAm对其生物学特性的影响,为rhAm后续开发应用奠定实验基础。方法:(1)利用基因克隆方法获取hAm-His基因,插入pET-22b载体,构建编码hAm-His重组蛋白的原核表达质粒pET-22b-Am-His。借助电转化技术将表达质粒导入大肠杆菌WK6中进行诱导表达,目的蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western Blotting对其进行鉴定。(2)利用基因克隆方法获取hAm-His基因,插入pCMV载体/pPIC9K载体,构建编码hAm-His重组蛋白的真核表达质粒pCMV-Am-His/pPIC9K-Am-His。借助瞬时基因转染技术将重组质粒pCMV-Am-His导入HEK 293F细胞,借助电转化技术将重组质粒pPIC9K-Am-His导入毕赤酵母GS115菌株。目的蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western Blotting检测对其进行鉴定。(3)用MTT检测,划痕实验,ALP检测试剂盒以及Western Blotting检测等方法比较不同来源的rhAm对hPDLFs和HS-5增殖、迁移、粘附以及细胞中ALP水平的影响和对HS-5中成骨分化标志物蛋白表达的影响。结果:(1)通过SDS-PAGE和Western Blotting检测的鉴定,在E.coli WK6及HEK293F细胞中获得了分子量约25kDa的rhAm。(2)大肠杆菌表达系统与哺乳动物细胞表达系统所表达的rhAm均能显著促进hPDLFs和HS-5的增殖、迁移、粘附和细胞内ALP水平的上调,还能促进HS-5中I型胶原、RunX2的表达,且二者的作用效果无显著性差异。结论:大肠杆菌表达系统与哺乳动物细胞表达系统所表达的rhAm都具有生物活性,且它们的生物活性相似。