【前言】结直肠癌及转移性结直肠癌显著地降低了患者的生活质量,严重威胁患者的生命健康,并为患者家庭带来沉重的经济负担。随着肠镜检查的普及,早期诊断发现结肠直肠癌的患者一般具有良好的预后,但仍有约20%的结肠直肠癌患者在首次诊断时就已有肿瘤转移;对于这部分患者,其5年生存率仅有13%。转移发生的部位及转移病灶的数量与患者的生存时间密切相关。结直肠癌转移的主要靶器官是肝脏和肺,晚期患者还将可能出现包括骨转移、脑转移在内的全身多部位转移。但决定结直肠癌转移模式的潜在机制目前仍未被阐明。肝脏血流丰富,门静脉系统是其主要血流来源,临床研究表明,肠道静脉引流进入门静脉系统可能与结直肠癌的肝转移密切相关。肺也是多种不同类型原发肿瘤转移的重要靶器官,部分原因可能是我们的整个心输出量通过肺毛细血管网络循环,有利于肿瘤细胞团块嵌入毛细血管并最终渗出、定植。但肿瘤的转移的模式和靶器官的选择并不能完全用血液或者淋巴的引流来解释。早在19世纪,就有研究者提出肿瘤转移的―种子‖和―土壤‖的假说:将播散的肿瘤细胞比喻为―种子‖,将肿瘤细胞定植的组织和器官比喻为―土壤‖,认为播散的肿瘤细胞(―种子‖),只有遇到适合其生长的组织微环境(―土壤‖)时才会定植。在临床实践中人们发现,消化系统肿瘤更容易发生肝转移和肺转移,葡萄膜黑色素瘤特别倾向于转移到肝脏,肉瘤更倾向于发生肺转移,而前列腺癌更容易发生骨转移,却很少发生肝转移和肺转移。肿瘤细胞在每个步骤均具有的特定的表型特征,原发肿瘤细胞在转移过程中所获得的遗传和表观遗传改变有助于肿瘤细胞和宿主的相互作用。因此研究原发性肿瘤和转移性肿瘤之间的基因表达的相似性和差异性,将有助于解析转移过程中靶器官选择的分子机制,并为预防及改善转移性肿瘤的治疗的提供有益的参考。【研究目的】现今大量的研究多采用分子生物学方法来解析转移过程中某一基因及其产物在促进或抑制转移过程中的具体变化,少有研究关注转移过程中的这类基因或其产物在整体转录水平的变化。本研究拟在宏观尺度上,采用严谨的生物信息学和统计学方法,对结直肠癌转移样本的高通量基因阵列数据集进行了分析,以识别出与结直肠癌细胞肝转移和肺转移的密切相关的关键基因及关键信号通路,并以此构建能预测结直肠癌肝转移和肺转移的回归模型。【研究方法】本研究中使用三组GEO数据库中的人结直肠癌样本的基因表达芯片数据集和本院的结直肠癌临床样本为研究对象。使用File Zilla软件下载全部入选样本的基因表达芯片的原始数据集。使用R语言和Rstudio为分析和研究平台。使用affy软件包,通过基因芯片原始文件,读取芯片原始文件中的所有样本中的所有已知基因的表达值。使用imput软件包,采用最近邻平均算法补齐缺失值。使用sva软件包,通过经验贝叶斯算法移除三个数据集之间的批次效应。使用主流的基因差异表达软件包limma,计算出各样本分组之间差异表达基因(DEGs)。差异表达基因的选取标准为:Adjusted p value(FDR)<0.01并且|log2(Fold Change)|>1。使用蛋白互作分析平台STRING,绘制出肝转移和肺转移相关差异表达基因的蛋白或者网络。使用Cytoscape软件进行蛋白质-蛋白质互作网络关系的可视化。使用Cytoscape软件中的Clue Go插件对肝转移和肺转移差异表达基因进行GO生物学过程注释和KEGG通路分析,绘制基因功能网络图。使用最佳子集回归、向后逐步回归进一步筛选肝转移和肺转移差异基因。使用本院的结直肠癌肝转移和肺转移样本的石蜡切片提取总RNA,通过q RT-PCR获取基因的表达值。使用ROC曲线为验证工具,使用临床样本的基因表达数据作为验证数据集,评估自建的回归模型在预测结直肠癌肝转移和肺转移样本的效能。【研究结果】1、根据纳入和排除标准选择三个GEO数据集(GSE68468,GSE41258和GSE49355)进行分析。共纳入712个样本的基因表达阵列数据,包括392个原发性结直肠癌组织,127个正常结肠组织,113个肝转移组织,26个正常肝组织,40个肺转移组织和14个正常肺组织。通过组与组之间的比较找到:1832个[肝转移组织vs.正常肝脏组织]的差异表达基因;1243个[肺转移组织vs.正常肺组织]的差异表达基因;1765个[正常肝组织vs.正常结肠组织]的差异表达基因;1242个[正常肺组织vs.正常结肠组织]的差异表达基因;680个[肝转移组织vs.正常结肠组织]的差异表达基因;602个[肺转移组织vs.正常结肠组织]的差异表达基因;482个[原发结直肠癌组织vs.正常结肠组织]的差异表达基因。2、借助韦恩图工具,最终筛选出104个结直肠癌肝转移相关的差异表达基因,135个结直肠癌肺转移相关的差异表达基因。其中,45个差异表达基因为肝转移和肺转移共有的、59个差异表达基因为结直肠癌肝转移独有、90个差异表达基因为结直肠癌肺转移独有。肝转移与肺转移相关的差异表达基因谱存在较大差异,说明导致结直肠癌细胞发生肝转移与肺转移的机制可能存在较大差异。3、KEGG通路分析发现:包括矿物质吸收和蛋白质消化吸收在内的2条KEGG通路主要富集于肺转移;脂肪消化吸收、抗坏血酸和醛糖代谢、戊糖和戊糖相互转化等KEGG通路主要在肝转移中富集;IL-17信号通路在肝和肺转移灶中均有富集。4、GO生物学过程分析发现以下功能主要集中在肺转移:c AMP介导信号转导调控、对锌离子的应答、铜离子的解毒作用、细胞对铜离子的应答、细胞锌离子的体内稳态、通过调节螯合钙离子的释放来调节心肌的收缩、正向调节钙离子跨膜转运、钙离子跨膜转运蛋白活性的正向调节。包括内胚层细胞分化、细胞外渗、动脉形态发生、主动脉形态发生、涉及离子跨膜转运活性调节在内的功能在肝转移和肺转移中均有富集。没有任何GO生物学过程仅仅富集于肝转移。5、通过最佳子集回归和逐步向后回归进一步筛选基因,我们最终挑选出一个包含7个基因的基因集,用于构建预测结直肠癌肝转移和肺转移的回归模型。这7个基因是:SPARC、COL1A2、MMP9、COL11A1、CXCL12、COL3A1和THBS2,这个基因集组成的回归模型具有最少的基因数量和最大的adjusted R-squared值(0.63)。6、从陆军军医大学新桥医院病理科的档案库中筛选出福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织形式的48份临床样本。包括通过结肠镜检查或结肠切除术收集的19例原发性结直肠癌,通过部分肝切除术或肝脏活检收集的21例肝转移,通过肺部分切除术或肺活检收集的8例肺转移。再通过q RT-PCR验证基因的表达水平。在肺转移标本中,MMP9,COL11A1,CXCL12和THBS2的m RNA表达明显高于肝转移,COL3A1的m RNA表达显著低于肝转移,SPARC和COL1A2的m RNA表达与肝转移无显着性差异。然后将这7个预测基因的表达值用作验证数据集,用以评估回归模型的性能。7、使用通过临床FFPE样本所获得的基因表达数据作为验证数据集,通过ROC曲线的AUC来评估模型的预测能力。结果显示7个基因组成的区别结直肠癌肝转移和肺转移的逻辑回归模型的ROC AUC为83.9%,说明我们可以通过7个基因的表达情况有效的预测结直肠癌肝转移和肺转移。进而说明,这7个基因的表达情况参与了调控了结直肠癌细胞远处转移部位的选择。【结论】1、结合所有肝转移和肺转移独有基因和共有基因的通路分析和GO生物过程分析,我们发现:(1)参与金属离子迁移和吸收、调节细胞间基质降解的基因,对肺转移至关重要;(2)参与糖、蛋白、氨基酸、脂质和能量代谢的基因是肝转移形成的关键基因;(3)参与动脉形态发生、通过趋化因子形成肿瘤微环境、内胚层细胞分化的基因在结直肠癌肝转移和肺转移均为关键基因。2、在结肠直肠癌中,通过SPARC、COL1A2、MMP9、COL11A1、CXCL12、COL3A1、THBS2共7个基因的表达值构建的区别结直肠癌肝转移和肺转移的逻辑回归模型能有效的预测结直肠癌肝转移和肺转移。这7个基因的表达情况参与调控了结直肠癌细胞远处转移靶器官的选择。【意义】本研究采用严谨的生物信息学和统计学方法,对结直肠癌转移样本的高通量基因阵列数据集进行了分析,并在临床转移样本中进行验证,在宏观尺度上,识别出7个与结直肠癌肝转移和肺转移的密切相关的关键基因及信号通路,并以此构建能预测结直肠癌肝转移和肺转移的回归模型。将为进一步解析肿瘤转移靶器官选择的分子机制提供参考,并为结直肠癌转移的精准治疗提供潜在的分子靶点。【前言】幽门螺杆菌感染能诱发胃粘膜内显著的炎症反应,伴有巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞和多核白细胞在内的多种免疫细胞的浸润,但却并不能清除幽门螺杆菌,导致慢性感染和胃粘膜组织持续性损伤。虽然幽门螺杆菌在胃粘膜中的持续定植和慢性感染的机制尚不清楚,但现有研究认为,在幽门螺杆菌感染中,胃上皮细胞与胃粘膜免疫的相互作用是一个关键的促成因素。因此,解析胃粘膜免疫中的关键分子与幽门螺杆菌的相互作用及其机制将有望为幽门螺杆菌的根除、慢性胃炎的治疗及胃癌的预防提供有益的参考。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)不仅是细胞间质中的重要组分,也存在于几乎所有细胞的表面。HSPGs的侧链为各种生物活性分子(细胞因子、趋化因子、生长因子、酶、蛋白酶抑制剂等)提供了无数的锚定位点。在炎症反应中,肝素酶可以通过释放结合在HSPGs上的趋化因子和细胞因子,促进固有免疫细胞活化和迁移,进而调控炎症细胞对炎症刺激的应答。现有研究发现,肝素酶在多种炎性疾病中高表达,但在不同的组织和疾病模型中具有不同的作用。肝素酶在急性胰腺炎、急性血管炎、急性肾小球肾炎、过敏性肺炎中发挥促炎作用;而在中枢系统炎症(阿兹海默病)中,高表达的肝素酶却可以抑制巨噬细胞清除β淀粉蛋白,减轻炎症反应。但肝素酶在幽门螺杆菌感染的慢性胃炎中的作用和机制却仍不清楚。【研究目的】1)研究肝素酶在幽门螺杆菌感染胃粘膜组织中的表达和来源;2)研究肝素酶对胃炎炎症程度和幽门螺杆菌定植的影响;3)研究肝素酶对幽门螺杆菌感染慢性胃炎中浸润的免疫细胞的数量和功能的影响及其机制【研究方法】1)H.pylori感染慢性胃炎患者、慢性萎缩性胃炎患者和健康人的新鲜胃粘膜组织,通过免疫荧光、免疫组化检测肝素在H.pylori慢性感染胃炎中的表达情况。2)从以色列理工大学获取肝素酶敲除(HPA-KO)小鼠。从南昌大学第一附属医院获取幽门螺杆菌PMSS1菌株。使用H.pylori PMSS1建立小鼠H.pylori感染慢性胃炎模型。3)通过HE染色和银染色鉴定H.pylori在胃粘膜中的定植情况。4)使用免疫荧光检测胃粘膜上皮细胞全细胞角蛋白(Pan-cytokeratin)抗体和肝素酶抗体的表达,检测肝素酶在胃粘膜组织中的细胞来源。5)使用人胃粘膜上皮细胞系,通过q RT-PCR和Western Blot,检测不同时间点和不同幽门螺杆菌MOI对胃粘膜上皮细胞细胞肝素酶表达的影响。6)通过HPA-KO小鼠和WT小鼠,检测肝素酶表达情况对胃粘膜炎症程度、免疫细胞浸润、促炎细胞因子的影响。7)使用HPA-KO小鼠、WT小鼠、人的H.pylori慢性感染胃粘膜组织,通过Taqman探针PCR检测肝素酶表达水平对幽门螺杆菌定植的影响以及肝素酶表达水平和H.pylori定植的关系。8)使用q RT-PCR检测常见炎症细胞NK1.1、Gran B(NK细胞)、Langarin(树突状细胞)、F4/80(巨噬细胞)、Ly6g(中性粒细胞)表面标记物在胃粘膜中的表达。初步确定肝素酶的表达水平能影响H.pylori感染胃炎粘膜内巨噬细胞的数量。9)通过流式细胞学,进一步确认了肝素酶缺失可以减少H.pylori感染胃炎胃粘膜组织内的巨噬细胞数量。10)通过q RT-PCR检测不同肝素酶表达水平对巨噬细胞活化标志物i NOS及促炎细胞因子的表达的影响。通过Western Blot检测不同肝素酶表达水平对巨噬细胞M1极化标志物i NOS蛋白水平表达的影响。11)通过Western Blot检测不同肝素酶表达水平下,H.pylori刺激腹腔巨噬细胞将导致哪些信号通路活化。【结果】1)肝素酶在人和小鼠的幽门螺杆菌感染胃炎组织中高表达2)人和小鼠的幽门螺杆菌感染胃炎组织中,高表达的肝素酶主要来自胃粘膜上皮细胞3)肝素酶加重幽门螺杆菌感染胃炎的炎症程度并促进幽门螺杆菌定植4)肝素酶促进巨噬细胞在幽门螺杆菌感染慢性胃炎组织内的浸润5)肝素酶促进幽门螺杆菌诱导的巨噬细胞极化6)肝素酶通过调控p38 MAPK和NF-κB通路促进幽门螺杆菌诱导的巨噬细胞极化【结论】我们首次报道了幽门螺杆菌可以促进肝素酶在胃炎中高表达,高表达的肝素酶通过调控p38 MAPK和NF-κB通路促进幽门螺杆菌诱导的巨噬细胞M1极化,增加促炎细胞因子的表达进而加重胃炎。