第一部分去SUMO化对结肠炎的影响以及结肠炎SUMO化修饰蛋白调控通路背景:近年来溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）发病率增长迅速,然而发病机制尚不明确。小泛素化（small ubiquitin-like modifier,SUMO）是重要的蛋白质翻译后修饰方式,其修饰蛋白介导转录调控、细胞增殖等多种细胞功能,且UC发病机制关键通路蛋白也有SUMO修饰蛋白。然而,UC发病机制中受SUMO修饰调控的蛋白质全貌尚不完全清晰。目的:通过硫酸钠葡聚糖（dextran sulfate sodium,DSS）结肠炎模型,从蛋白质组学、转录组学多角度多维度,探究结肠炎中有哪些通路和SUMO修饰相关;期望通过本研究能深入了解SUMO化修饰在UC发生发展中的地位,为未来寻找UC治疗靶点提供线索。方法:1、采用2-D08和/或DSS干预小鼠建立去SUMO化DSS结肠炎模型,建模中间时间点剪取鼠尾验证SUMO表达量,造模结束予结肠炎活动度和病理损伤评分,取结肠组织完成蛋白组学测序及分析,验证富集通路的关键蛋白。2、对基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）的DSS结肠炎转录本进行 SUMO 化关键酶泛素结合酶 E2I（ubiquitin-conjugating enzyme E2I,UBE2I 或UBC9）相关基因的加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network analysis,WGCNA）,并验证核心基因。3、整合关键基因模块和蛋白质组学信息并探究SUMO化相关基因富集通路。结果:1.（1）去SUMO化DSS结肠炎小鼠与DSS结肠炎组小鼠相比,结肠短缩程度及病理损伤程度均较轻（P值＜0.05）。（2）蛋白质组学分析结果提示去SUMO结肠炎小鼠结肠组织有多条通路受到影响,涉及结肠炎的保护性通路和促炎通路。去SUMO化结肠炎组激活了 Rap1-p38MAPK信号通路、粘附连接通路等具有炎症保护作用的通路,同时也影响中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps,NETs）形成通路、胆汁酸代谢通路等炎症相关通路。（3）和DSS结肠炎组相比,去SUMO化DSS结肠炎小鼠结肠组织中通路关键蛋白质NE表达无改变（P值=0.313）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）表达下降（P值=0.0244）、p38MAPK表达减低（P值=0.043）。2.（1）从GEO数据库中筛选出DSS结肠炎数据集GSE42768、GSE134281和GSE71920,去批次效应后合并的数据集共筛选出UBE2I相关基因5464个;具有286 个差异表达基因（differential gene expression,DEGs）,可进行后续 WGCNA。（2）WGCNA获得和结肠炎相关性强的褐色基因模块（相关系数=0.87）和蓝绿色基因模块（相关系数=-0.83）,褐色基因模块富集于蛋白质合成、加工通路,而蓝绿色模块富集于感染、代谢、药物反应途径。（3）验证核心基因Sulf2、Rar、Cyp2f2、Esrrg、VDR和Ube2i的mRNA相对表达,结果显示和对照小鼠相比,在结肠炎小鼠结肠组织中,Sulf2、Rars和Ube2i表达升高,Cyp2t2、Esrrg和Vdr表达减低。3.整合蛋白组学和转录本信息,结果显示蛋白质UBE2I参与跨核膜转运、NF-κB信号通路、泛素介导的蛋白质降解通路,SUMO相关蛋白VDR参与钙重吸收通路、受体激活通路,最终调控基因转录等多个功能。结论:1.SUMO化修饰关键酶E2结合酶（UBE2I/UBC9）的抑制剂（2-D08）处理DSS结肠炎模型,可影响DSS炎症反应。2.蛋白质组学和转录组学分析提示结肠炎中多条信号通路关键蛋白受到SUMO修饰。第二部分维生素D受体SUMO化修饰对蛋白质稳定性及结肠上皮细胞功能的影响背景:维生素D受体（vitamin D receptor,VDR）调节细胞增殖、细胞凋亡、炎症反应等多种功能。已有研究显示VDR是SUMO化修饰蛋白质,但SUMO修饰对VDR下游通路的影响,以及SUMO修饰调控VDR对结肠上皮功能的影响了解甚少。目的:明确VDR和SUMO蛋白的相关性以及相互作用,构建VDR的SUMO化修饰突变体,并探索SUMO化修饰对VDR蛋白质稳定性和结肠上皮细胞功能的影响。方法:1.VDR和SUMO的相关性:分析转录组数据集GSE16879中VDR和SUMO的表达情况,并收集行结肠镜检查的UC患者和非UC患者各5例,采用qPCR实验探索结肠组织中VDR和SUMO的mRNA表达情况及相关性。2.VDR和SUMO的相互作用:采用小鼠结肠组织进行免疫共沉淀实验。3.构建VDR点突变稳转细胞:对VDR进行点突变,构建VDR的SUMO化修饰突变体质粒,采用VDR和VDR的SUMO修饰突变体质粒包装病毒,构建稳定表达转染细胞系。4.SUMO对VDR蛋白质稳定性的影响:利用放线菌酮（cycloheximide,CHX）干预稳转细胞系检测对VDR蛋白质稳定性的影响。5.SUMO对VDR下游功能的探索;MG132干预稳转细胞系检测对VDR泛素化降解通路的影响;利用细胞增殖检测实验（CCK-8）检测TNF-α干预下VDR的SUMO修饰对细胞增殖能力的影响,并采用维生素D类似物进行回补实验;利用TNF-α干预稳转细胞探索SUMO修饰VDR对细胞紧密连接蛋白E-cadherin、Occludin、ZO-1,还有对下游炎症因子IL-1β表达的影响。结果:1.和非UC患者相比,公共数据库中UC患者的VDR和SUMO蛋白表达减低（P值＜0.001）,而我们的验证结果中,UC患者的VDR表达减低（P值=0.0127）,SUMO2/3表达有降低趋势,SUMO2/3和VDR的表达呈正相关性（相关系数=0.49）。2.采用VDR对小鼠结肠组织进行免疫沉淀,然后采用SUMO2/3抗体进行免疫印迹,结果显示在VDR分子量处有迁移条带,VDR和SUMO2/3存在相互作用,即VDR为SUMO化修饰蛋白。3.将VDR的N末端第91位、第103位和第111位赖氨酸碱基（AAG）突变为精氨酸（AGG）,并将VDR及突变后的VDR的5’端加上Flag标签序列,连接在慢病毒载体pLV-EF1a-EGFP（2A）Puro上,对载体包装病毒后感染HCT116结肠上皮细胞,筛选后即获得VDR稳转细胞以及VDR的SUMO化修饰突变体稳转细胞（3K3R细胞）,稳转细胞系均有增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）表达。4.CHX干预稳转细胞系不同时间梯度后,VDR稳转细胞的蛋白质水平逐渐下降,而3K3R细胞中VDR蛋白质下降更为明显。5.（1）MG132干预稳转细胞不同时间梯度后,VDR稳转细胞系VDR蛋白递增,而3K3R细胞系则VDR蛋白质表达相对稳定。（2）TNF-α干预不同时长后,3K3R细胞的细胞增殖效率比VDR稳转细胞高（最终细胞增殖倍数:3K3R vs VDR 1.02±0.06 vs 0.90±0.07;P值=0.0002）,但增殖效率均低于对照组细胞。在进行维生素D类似物卡泊三醇预处理之后,VDR或3K3R细胞的增殖效率均低于未经卡泊三醇处理的相应细胞（P值＜0.0001）,而VDR细胞和3K3R细胞随时间变化的差异率也有所减小（P值=0.02）。（3）qPCR和Western Blot的实验结果提示,经过校正,炎症因子TNF-α刺激后上皮细胞的E-cadherin、Occludin、ZO-1的mRNA和蛋白质水平均减低,而VDR稳转细胞的紧密连接蛋白表达量比正常对照和3K3R细胞高。（4）在经过TNF-α刺激12小时后,VDR稳转细胞中IL-1β表达明显低于对照组,但和3K3R细胞没有差异。结论:VDR和SUMO蛋白的表达具有相关性,且VDR是一个SUMO化修饰蛋白质。VDR的SUMO化修饰位点有3个,全部SUMO化修饰位点突变后,VDR蛋白质通过泛素化途径增加降解速度;SUMO化修饰可起到维持VDR抗细胞增殖的作用,还可维持VDR介导的紧密连接功能的稳定性。第三部分VDR是预测TNF-α抑制剂治疗溃疡性结肠炎的重要蛋白背景:英夫利西单抗是治疗溃疡性结肠炎（UC）患者应用最广泛的生物制剂,然而,有三分之一的UC患者存在原发失应答（primary non-response,PNR）。目前临床尚无用于预测PNR的有效指标。目的:从转录组数据库中筛选出可用于预测UC患者IFX原发失应答的指标,并探索其应用的稳定性和可行性。方法:1.分析3个GEO数据集,并使用RobustRankAggreg（RRA）算法辅以筛选出IFX应答和失应答的整合差异表达基因构建预测模型。2.采用重抽样联合人工神经网络（artificial neural network,ANN）分析的Bootstrap分析方法对模型的预测价值进行评估,并采用独立转录组数据集进行验证。3.采用临床大体标本进行免疫组织化学（IHC）实验探索该模型中指标在蛋白质层面的表达情况,并使用ROC曲线分析筛选出预测阈值。结果:我们采用RRA算法辅助筛选出6个基因组合（CDX2、CHP2、HSD11B2、RANK、NOX4和VDR）用于预测UC患者的IFX治疗原发失应答。Bootstrap法表明6个基因组成的模型对IFX原发失应答的预测价值AUC范围为0.850±0.103;而独立验证数据集的AUC范围为0.759±0.065;预测结果具有稳定性。经过IHC实验,VDR和RANK的IHC染色结果与IFX疗效显著相关（P值＜0.05）;治疗前结肠组织中VDR的总IHC评分低于5,RANK的总IHC评分低于7,对于预测 PNR 的 AUC 为 0.828（95%CI:0.665～0.991,P 值=0.013）,敏感性为 82.4%,特异性为71.4%。结论:RNA和蛋白质模型之间存在联系,两种模型都可用于预测IFX原发失应答。而VDR联合RANK的蛋白质模型临床应用性更强。