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研究背景:心力衰竭作为多种心血管疾病的终末阶段,对人类健康构成严重威胁,其预防与治疗是目前心血管疾病的防治重点。病理性心肌肥厚是导致心衰的重要因素,已有研究表明,钙超载、氧化应激、线粒体自噬、炎性反应等均参与心肌肥厚的发生发展,因此有效防治心肌肥厚是阻止心力衰竭发生的重要策略。既往研究表明,炎性反应在心血管疾病的发病过程中起着重要作用。细胞焦亡是一种程序性细胞死亡方式,主要由NLRP3介导,与ASC结合促进pro-caspase1裂解为成熟的caspase1,caspase1进而切割GSDMD形成跨膜孔,并释放IL-18、IL-1β等炎症因子,导致炎症级联反应放大。热量限制（caloric restriction,CR）是一种在保证生物体不发生营养不良的情况下,限制每日摄取总热量的饮食控制方法。已报道CR对多种年龄相关的疾病,如心血管疾病、肿瘤、Ⅱ型糖尿病等代谢性疾病均产生有益影响。由于长期严格的CR在人类难以实施,因此人们探索发现了一系列CR的替代物,即热量限制模拟物（caloric restriction mimetic,CRM）,包括二甲双胍、白藜芦醇、雷帕霉素、壳聚糖等。研究证实二甲双胍（Metformin,Met）及橙皮素（Hesperetin,Hes）都能模拟CR的延衰作用,作为CRM其能预防多种心血管疾病,减少心肌梗死面积,减轻动脉粥样硬化,减轻炎症,减少细胞死亡。本课题组前期实验表明,CR可以通过减少细胞焦亡来缓解心肌缺血再灌注损伤,但是CR及其模拟物对心肌细胞肥大有无减轻作用,以及是否与调控心肌细胞焦亡有关目前尚无定论。因此,本研究拟在心肌细胞肥大模型上,对CR和CRM的作用及可能机制进行探讨。目的:1.评估热量限制及其模拟物（橙皮素、二甲双胍）是否可缓解血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大;2.确定热量限制模拟物二甲双胍对心肌细胞肥大的减轻作用是否与NF-κB/NLRP3介导的细胞焦亡有关。方法:第一部分:（1）细胞分组:将H9c2心肌细胞分为以下几组:对照组、心肌细胞肥大模型组（AngⅡ）、CR治疗组（CR+AngⅡ）、橙皮素治疗组（Hes+AngⅡ）、二甲双胍治疗组（Met+AngⅡ）以及单纯CR,橙皮素,二甲双胍处理组;（2）CCK8法检测细胞活力;（3）鬼笔环肽染色检测心肌细胞表面积;（4）RT-qPCR法检测心肌细胞中肥大相关基因ANP、BNP、β-MHC的mRNA表达水平;（5）氧化应激指标SOD与MDA的活性测定利用相应试剂盒;ROS检测采用DCFH-DA荧光探针法;（6）反映心肌细胞损伤程度的指标LDH、MPO含量的检测采用相应试剂盒。第二部分:（1）细胞分组:对照组（Control）、血管紧张素Ⅱ组（AngⅡ1μmol/L）、二甲双胍组（Met 100μmol/L）、二甲双胍+血管紧张素Ⅱ组（Met+AngⅡ）、NF-κB抑制剂水杨酸钠组（CR+AngⅡ+Ss10μmol/L）、NF-κB激动剂白桦脂酸组（CR+AngⅡ+BA80μmol/L）;（2）RT-qPCR法检测心肌细胞中焦亡相关基因NLRP3、ASC、GSDMD、caspase1、IL-18与IL-1β的mRNA表达水平;（3）Western blot法检测焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、GSDMD、caspase1的表达量及NF-κB的蛋白表达量。结果:第一部分（1）建立AngⅡ诱导的H9c2心肌细胞肥大模型:设定Ang Ⅱ干预浓度梯度（0、0.01、0.1、1、10μmol/L）及时间梯度（0、6、12、24、48h）测定各组心肌细胞活力,结果显示与Contorl组相比,AngⅡ（1μmol/L）时细胞存活率为76%,10μmol/L的AngⅡ使细胞存活率降至49%,见图1A;此外,1μmol/L AngⅡ作用24h时细胞存活率为82%,作用48h时细胞存活率降至68%,见图1B;同时检测不同浓度Ang Ⅱ（0、0.01、0.1、1、10μmol/L）时心肌细胞的表面积,结果显示,1μmol/L AngⅡ（作用24h）可使H9c2心肌细胞的表面积较对照组增加2.1倍,达最大值,见图1C-D,因此选择AngⅡ（1μmol/L）作用24h作为建立H9c2心肌细胞肥大模型的后续实验条件。（2）确定CR、Hes及Met最佳干预浓度:参照文献CR用不同浓度的葡萄糖培养基（1、2、3、4、4.5g/L）对细胞进行处理,结果发现葡萄糖浓度2g/L时可使肥大的心肌细胞存活率最高,见图2A;此外在肥大的心肌细胞上分别设置Hes干预浓度梯度（0、0.125、0.25、0.5、1μmol/L）、Met干预浓度梯度（0、0.01、0.1、1、5mmol/L）,细胞活力检测结果显示Hes（0.25μmol/L）、Met（100μmol/L）干预可使肥大的心肌细胞存活率高,见图2B-C,故选择2g/L葡萄糖浓度的培养基来模拟CR,Hes（0.25μmol/L）、Met（100μmol/L）为最佳干预浓度进行后续实验。（3）CR能降低AngⅡ诱导的H9c2细胞肥大的程度:心肌细胞表面积检测结果发现,CR治疗使肥大的心肌细胞表面积明显减小,见图3A-B;而且CR干预也使肥大相关基因（ANP、BNP和β-MHC）mRNA表达量较Ang Ⅱ组分别下降了41%、22%、38%（P＜0.05）,见图3C-E,表明CR能够缓解心肌细胞肥大。（4）CR减轻肥大心肌细胞的氧化应激损伤:测定各组心肌细胞的ROS、SOD和MDA的表达,结果显示AngⅡ组的ROS及MDA含量较Control组分别增加了1.7、1.9倍,而SOD含量则降低了34%（P＜0.01）;与AngⅡ组相比,CR治疗则使ROS与MDA含量明显降低,SOD水平增加（P＜0.05）,见图4,表明CR可缓解心肌细胞的氧化应激损伤。（5）热量限制模拟物Hes与Met能降低AngⅡ所致的H9c2细胞肥大:鬼笔环肽荧光染色结果显示,与AngⅡ组相比,Hes或Met治疗均能使肥大心肌细胞的表面积明显减小（P＜0.05）,见图5A-B;此外,相对于Ang Ⅱ组,Hes或Met治疗均使肥大心肌细胞的ANP、BNP与β-MHC的mRNA表达量显著降低（P＜0.05）,并且Met治疗的作用更为明显（P＜0.05）,见图5C-E,表明热量限制模拟物橙皮素与二甲双胍均能缓解心肌细胞肥大。（6）CRM（Hes及Met）能缓解AngⅡ所导致的心肌细胞氧化应激损伤:ROS检测结果显示,与Control组相比,AngⅡ组的ROS荧光强度明显增加（P＜0.01）;而Hes或Met治疗则使ROS荧光强度较AngⅡ组分别降低了22%、29%（P＜0.05）,见图6,表明热量限制模拟物橙皮素与二甲双胍对肥大的心肌细胞具有抗氧化应激损伤的作用。（7）CR及CRM（Hes、Met）能够明显改善AngⅡ所导致的心肌细胞损伤:与对照组相比,AngⅡ组的细胞上清中LDH、MPO含量明显增加（P＜0.05）;与AngⅡ组相比,分别用CR、CRM（Hes、Met）干预后使细胞上清中的LDH、MPO含量明显降低（P＜0.05）,其中Hes使LDH减少34%,MPO减少21%;Met使LDH减少48%,MPO减少37%,见图7。相比之下,二甲双胍对肥大细胞损伤的缓解作用强于橙皮素（P＜0.05）。第二部分（1）Met可降低Ang Ⅱ诱导的肥大心肌细胞中焦亡相关基因的mRNA表达:RT-qPCR检测结果可见,与对照组相比,Ang Ⅱ组焦亡相关基因NLRP3、ASC、GSDMD、caspase1、IL-18、IL-1β的mRNA表达量显著增加（P＜0.01）;相较于AngⅡ组,Met+AngⅡ组使焦亡相关基因的表达量明显下调,分别是NLRP3（19%）、ASC（11%）、GSDMD（15%）、caspase1（27%）、IL-18（29%）、IL-1β（25%）（P＜0.05）,见图8,表明二甲双胍可减少肥大心肌细胞的焦亡。（2）Met抑制Ang Ⅱ诱导的肥大心肌细胞中焦亡蛋白的表达:Western blot检测结果显示,Ang Ⅱ组焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、GSDMD、caspase1的表达量显著高于对照组（P＜0.01）,而Met+AngⅡ组的NLRP3、ASC、GSDMD、caspase1表达量则较Ang Ⅱ组分别下调了29%、32%、22%、27%（P＜0.05）,见图9。（3）Met可逆转AngⅡ诱导的肥大心肌细胞中NF-κB表达量的上调:通过Western blot检测,发现AngⅡ组的NF-κB蛋白量较对照组增加了2.5倍,而Met干预则逆转了AngⅡ所致的NF-κB蛋白量增加（P＜0.05）;加用NF-kB抑制剂水杨酸钠后使NF-kB蛋白表达量降低了27%,加用NF-kB激动剂白桦脂酸后使心肌细胞中的NF-kB蛋白表达量增加了24%（P＜0.05）,提示二甲双胍的心肌细胞保护作用与调控NF-kB的表达有关,见图10。（4）NF-κB激动剂可去除Met对肥大心肌细胞焦亡的抑制作用:RT-qPCR检测结果显示,与AngⅡ组相比,Met可降低AngⅡ所致的心肌细胞焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD的mRNA表达量增加;在Met+AngⅡ基础上加用NF-κB抑制剂水杨酸钠进行干预,则使NLRP3、GSDMD的mRNA表达量较Met+AngⅡ组进一步降低,而加用NF-κB激动剂白桦脂酸则去除了Met抑制焦亡相关基因表达的作用,见图11,提示二甲双胍是通过抑制NF-κB而减少肥大心肌细胞发生焦亡的。结论:热量限制及热量限制模拟物（二甲双胍与橙皮素）可以缓解血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大,减轻氧化应激与细胞损伤,其中二甲双胍的心肌细胞保护作用与抑制NF-κB介导的细胞焦亡有关。