【摘 要】
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目的:肌少症是指随着机体衰老以骨骼肌质量减少、力量减弱为特征的一种慢性退行性疾病。研究表明衰老伴随着活性氧（reactive oxygen species,ROS）持续累积与骨骼肌减少密切相关。本实验采用叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide,t-BHP）诱导小鼠C2C12成肌细胞,探究黄芪中的主要成分环黄芪醇（cycloastragenol,CAG）是否对C2C12成肌
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目的:肌少症是指随着机体衰老以骨骼肌质量减少、力量减弱为特征的一种慢性退行性疾病。研究表明衰老伴随着活性氧（reactive oxygen species,ROS）持续累积与骨骼肌减少密切相关。本实验采用叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide,t-BHP）诱导小鼠C2C12成肌细胞,探究黄芪中的主要成分环黄芪醇（cycloastragenol,CAG）是否对C2C12成肌细胞氧化应激损伤有保护作用,并探讨环黄芪醇对Keap1/Nrf2抗氧化通路的调节机制,为骨骼肌减少相关疾病提供治疗思路。方法:1.体外培养C2C12细胞,采用t-BHP处理C2C12细胞建立细胞氧化应激模型。分别采用0、1、10、25、50、75、100、150、200μmol/L的t-BHP处理C2C12细胞6 h,CCK-8检测细胞活力,确定t-BHP的干预浓度。用0、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500μmol/L的环黄芪醇处理C2C12细胞24 h,CCK-8检测细胞活力,确定环黄芪醇的干预浓度。2.将C2C12细胞分为5组:Control组、t-BHP组（100μmol/L t-BHP）、环黄芪醇低剂量组（1μmol/L CAG+100μmol/L t-BHP）、环黄芪醇中剂量组（10μmol/L CAG+100μmol/L t BHP）、环黄芪醇高剂量组（20μmol/L CAG+100μmol/L t-BHP）。CCK-8检测不同浓度的环黄芪醇对t-BHP诱导C2C12细胞氧化损伤的影响;β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况;Ed U-488实验检测细胞增殖情况;DCFH-DA荧光探针法测定细胞的ROS水平;生化法检测细胞中MDA、SOD水平;Western blot检测Pax7、Myo D、Keap1、Cyto-Nrf2、Nuclear-Nrf2、HO-1蛋白表达量;细胞免疫荧光检测Nrf2核转位情况。3.敲低Nrf2,C2C12细胞分为6组（t-BHP干预浓度为100μmo/L,环黄芪醇干预浓度为20μmo/L）:Control组、t-BHP组、t-BHP+si-NC组、t-BHP+si-Nrf2组、t-BHP+si-Nrf2+CAG组、t-BHP+CAG组。DCFH-DA荧光探针法测定各组细胞ROS水平;Western blot检测Pax7、Myo D、HO-1蛋白表达量。结果:1.CCK-8结果显示,小于50μmol/L的t-BHP对C2C12细胞活力无明显影响,大于75μmol/L的t-BHP对C2C12细胞产生明显的细胞毒作用。1-100μmol/L的环黄芪醇处理后,细胞活力显著升高,而500μmol/L的环黄芪醇处理后,会产生明显的细胞毒性,抑制细胞活力。因此最终选用1、10、20μmol/L环黄芪醇处理C2C12细胞24 h,100μmol/L t-BHP处理C2C12细胞6 h,作为后续实验浓度。2.C2C12细胞经t-BHP诱导后,细胞中ROS、MDA表达量升高,SOD表达量减少,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞百分比升高,Ed U阳性增殖细胞减少,增殖相关蛋白Pax7、分化相关蛋白Myo D表达减少。与t-BHP组相比,环黄芪醇处理后能提高C2C12细胞活力,降低胞内ROS和MDA含量,提高SOD活性,Ed U阳性增殖细胞增多,环黄芪醇亦可促进细胞增殖、分化相关蛋白Pax7、Myo D的表达。环黄芪醇可通过抑制Keap1蛋白表达,促进Nrf2与Keap1解偶联后的入核表达,上调下游关键蛋白HO-1的表达。3.敲低Nrf2后,胞内ROS含量增加,HO-1蛋白水平下调,Nrf2/HO-1信号通路被抑制;Pax7、Myo D蛋白表达减少,成肌细胞增殖分化能力下降。结论:环黄芪醇可在C2C12细胞氧化损伤中发挥抗氧化保护作用,其抗氧化机制可能与抑制Keap1的表达、促进Nrf2核转位并上调下游靶分子HO-1表达相关;环黄芪醇还可促进成肌细胞增殖分化相关蛋白的表达,为肌少症的防治提供新的思路。
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