论文部分内容阅读
A型流感病毒（Influenza A virus,IAV）是严重危害人类和动物健康的重要病原。IAV感染可通过多种调节机制迅速诱发宿主先天免疫反应,这对于病原体的清除和宿主的存活至关重要。然而,过度的炎症反应即“炎性风暴”将导致宿主免疫致病。IAV的M2（matrix protein 2）基质蛋白,是一个在流感病毒致病中很重要的质子选择性离子通道蛋白,它可刺激激活NLRP3（NLR family pyrin domain containing3）炎症小体的形成。自噬发生在胞质,是一个将寿命较长的蛋白、受损的细胞器及蛋白聚集体等进行包裹后与溶酶体融合发生降解的过程。其分为自噬小体形成及自噬小体与溶酶体融合两个阶段。流感病毒M2蛋白不但能够参与流感病毒感染后自噬小体形成的起始过程,还可抑制自噬小体与溶酶体的融合。但是M2蛋白是如何调节自噬的诱导过程及其与天然免疫之间的关系目前尚不清楚。另外,IAV也可通过多种复杂的免疫逃避机制以逃避宿主的免疫应答反应。其中,由IAV聚合酶蛋白PB1（Polymerase basic protein 1）编码的辅助蛋白PB1-F2可以使线粒体膜电势坍塌,且与线粒体抗病毒信号蛋白MAVS（mitochondrial antiviral protein）相互作用抑制宿主抗病毒天然免疫反应。然而,PB1-F2蛋白抑制天然免疫反应的详尽机制仍不清楚。线粒体自噬是选择性自噬的一种,是将受损的线粒体（膜电势下降）进行特异性的包裹后与溶酶体融合发生降解的过程。线粒体自噬能够负向调节天然免疫。之前文献报道A/PR8（H1N1）流感病毒感染能够诱导线粒体自噬但其具体分子机制尚不清楚。那么,PB1-F2蛋白是否能够介导IAV诱导的线粒体自噬以及线粒体自噬与PB1-F2蛋白削弱的天然免疫之间的关系尚不清楚。本研究通过探究M2及PB1-F2蛋白对自噬过程的影响揭示了M2与PB1-F2蛋白调节天然免疫反应的分子机制,主要内容如下:1.流感病毒M2蛋白通过与MAVS相互作用及增加ROS产量调节MAVS介导的信号通路1)M2蛋白定位于线粒体,促进线粒体融合,增加线粒体数量很多离子通道蛋白能够部分定位于线粒体且影响线粒体动态,我们分别通过SIM、间接免疫荧光及胞质线粒体分离实验证实M2蛋白在病毒感染及过表达情况下均能靶向于线粒体,并降低线粒体分裂蛋白的表达从而促进线粒体融合。另外,过表达M2蛋白可促进介导线粒体新合成的蛋白的表达进而增加线粒体数量。而过表达M2蛋白离子通道活性丧失突变体M2H37G或用离子通道活性抑制剂金刚烷胺（amnatadine）处理却丧失或削弱了上述效应,表明M2蛋白上述功能的体现依赖于其离子通道活性。2)M2蛋白拮抗自噬过程增强宿主抗病毒天然免疫反应本研究通过western blot与间接免疫荧光实验发现M2蛋白不仅抑制自噬溶酶体的形成,还诱导PI3K-AKT-MTOR依赖的自噬小体的形成。进一步研究发现M2蛋白触发的离子通道活性依赖的Ca2+与ROS产量参与了M2蛋白诱导的自噬过程。SDD-AGE检测结果表明M2蛋白增加了ROS依赖的MAVS聚集体的形成且依赖于其离子通道活性。另外,M2蛋白拮抗自噬并与自噬基因ATG5和LC3B竞争性的与MAVS结合,减少了ATG5-MAVS及LC3B-MAVS复合物的形成,降低了MAVS聚集体的降解,从而增强了MAVS介导的天然免疫反应。2.流感病毒PB1-F2蛋白通过诱导线粒体自噬抑制宿主抗病毒天然免疫反应1)PB1-F2蛋白诱导TUFM介导的线粒体自噬因为副流感病毒HPIV3的线粒体蛋白M能够介导线粒体蛋白TUFM（Tu translation elongation factor,mitochondrial）依赖的线粒体自噬,我们同样发现流感病毒PB1-F2蛋白介导了IAV感染诱导的线粒体自噬。有趣的是,将PB1-F2进行分析我们发现PB1-F2具有典型的LIR（LC3 interacting region）（W（61）××L（64））保守基序,并且PB1-F2蛋白的LIR突变体(PB1-F2W61A、PB1-F2W61A+L64A与PB1-F2△LIR)均丧失了与LC3B相互作用及诱导线粒体自噬的能力,说明此基序是PB1-F2与LC3B结合且诱导线粒体自噬的关键区域。此外,我们构建了TUFM突变体（TUFM△domain I、TUFM△domain II与TUFM△domain III）发现TUFM domain I是其与PB1-F2结合的关键区域。因此,PB1-F2扮演了自噬受体蛋白的角色同时与LC3B及TUFM domain I相互作用从而介导了线粒体自噬的发生。2)PB1-F2蛋白抑制线粒体自噬依赖的I型IFN的产生我们发现沉默掉TUFM及自噬基因ATG5（autophagy related 5）或过表达PB1-F2的LIR突变体抑制线粒体自噬过程均削弱了PB1-F2抑制I型IFN（interferon）产生及其降解MAVS蛋白的能力。说明PB1-F2拮抗天然免疫反应依赖于其诱导的线粒体自噬过程。本研究揭示了流感病毒M2蛋白拮抗自噬增强MAVS介导的天然免疫反应的具体机制,及PB1-F2蛋白通过介导自噬体向线粒体募集进而诱导线粒体自噬从而抑制I型IFN产生的分子机制,为流感病毒M2与PB1-F2蛋白与宿主天然免疫相互作用提供了新的见解,为开发新型抗流感病毒药物提供潜在的靶点。