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炎症反应是机体抵御外源病菌感染或修复内源组织损伤时恢复内环境稳态而采取的免疫调节反应。脊椎动物中的研究表明，适度的炎症反应可以加速机体清除入侵的病原体并迅速修复已损伤的组织，但是过度的炎症反应则会导致机体内环境稳态失衡，最终导致机体出现炎性疾病，然而软体动物中关于炎症反应的研究仍处于起步阶段。本研究以软体动物长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象，采用分子生物学、免疫学和细胞生物学等技术，克隆并分析了长牡蛎程序性死亡因子4(PogrammedCellDeathProtein4，命名为CgPDCD4)的分子特征及表达模式，解析了免疫刺激后CgPDCD4的表达规律及其对长牡蛎白细胞介素17(Interleukin 17，CgIL17)合成的调节作用，探究了CgPDCD4对细胞凋亡的调控作用，取得的研究结果主要如下：
1.克隆得到了CgPDCD4基因的开放阅读框(ORF)，其ORF全长为1344bp，能编码含447个氨基酸残基的多肽蛋白。生物信息学分析发现，CgPDCD4蛋白的序列和结构域较为保守，含有典型的MA-3结构域和真核翻译起始因子4A(eukaryotic translation initiation factor 4 A，eIF4A)结合位点RKR基序。通过构建系统进化树发现，CgPDCD4首先与虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)和光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)PDCD4聚类成为软体动物分支，随后与囊舌虫(Saccoglossus kowalevskii)、烟粉虱(Bemisia tabaci)、湿木白蚁(Zootemopsis nevadensis)和果蝇(Drosophila melanogaster)等PDCD4聚类形成无脊椎动物分支，最后与斑马鱼、人类和小鼠等脊椎动物分支聚在一起。荧光实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)检测基因表达水平发现，CgPDCD4的mRNA在多种组织中呈组成型表达，在闭壳肌和血淋巴细胞中表达量较高。免疫荧光法检测亚细胞定位显示，CgPDCD4蛋白在静息状态下主要定位于长牡蛎血淋巴细胞的细胞质中。
2.LPS刺激后长牡蛎血淋巴细胞中CgPDCD4的mRNA表达3h后开始显著下调，在48h后表达量达到最低，分别是PBS对照组的0.61±0.13(p＜0.05)倍和0.25±0.06(p＜0.01)倍。体内注射dsRNA干扰长牡蛎血淋巴细胞中CgPDCD4表达发现，PDCD4-RNAi组CgIL17-5的表达量在LPS刺激后的6h显著上调，是EGFP组的2.84±0.88(p＜0.01)倍，但是CgRel(长牡蛎中NF-κB的同系物)的核转位水平在两组之间未见显著性变化差异。结果表明在LPS刺激下，CgPDCD4可显著抑制长牡蛎血淋巴细胞中CgIL17-5mRNA表达。
3.长牡蛎在干露条件下，CgPDCD4mRNA表达在早期未见显著变化，在干露胁迫后第三天，开始显著上调并达到峰值，为空白组的3.91±0.91(p＜0.01)倍。将CgPDCD4转染至HEK293T细胞中，发现转染后的24h，CgPDCD4转染组对caspase-3和caspase-8的底物水解水平相比于空载组明显提高(p＜0.05)，结果表明CgPDCD4可响应干露胁迫并显著促进caspase蛋白的激活。
综上研究结果表明，长牡蛎CgPDCD4分子在进化上高度保守，其蛋白含有典型的MA-3结构域和RKR基序。CgPDCD4能在免疫应答后期下调表达，调节炎症因子CgIL17-5的合成，但其介导的具体合成机制与脊椎动物同源物存在差异。CgPDCD4能响应干露环境的胁迫，促进caspase蛋白酶的活化并调节细胞凋亡。研究结果初步阐明了长牡蛎中PDCD4在固有免疫应答中所起的调节作用，为进一步揭示无脊椎动物的细胞因子合成和炎症调节机制提供了重要的的理论依据。
1.克隆得到了CgPDCD4基因的开放阅读框(ORF)，其ORF全长为1344bp，能编码含447个氨基酸残基的多肽蛋白。生物信息学分析发现，CgPDCD4蛋白的序列和结构域较为保守，含有典型的MA-3结构域和真核翻译起始因子4A(eukaryotic translation initiation factor 4 A，eIF4A)结合位点RKR基序。通过构建系统进化树发现，CgPDCD4首先与虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)和光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)PDCD4聚类成为软体动物分支，随后与囊舌虫(Saccoglossus kowalevskii)、烟粉虱(Bemisia tabaci)、湿木白蚁(Zootemopsis nevadensis)和果蝇(Drosophila melanogaster)等PDCD4聚类形成无脊椎动物分支，最后与斑马鱼、人类和小鼠等脊椎动物分支聚在一起。荧光实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)检测基因表达水平发现，CgPDCD4的mRNA在多种组织中呈组成型表达，在闭壳肌和血淋巴细胞中表达量较高。免疫荧光法检测亚细胞定位显示，CgPDCD4蛋白在静息状态下主要定位于长牡蛎血淋巴细胞的细胞质中。
2.LPS刺激后长牡蛎血淋巴细胞中CgPDCD4的mRNA表达3h后开始显著下调，在48h后表达量达到最低，分别是PBS对照组的0.61±0.13(p＜0.05)倍和0.25±0.06(p＜0.01)倍。体内注射dsRNA干扰长牡蛎血淋巴细胞中CgPDCD4表达发现，PDCD4-RNAi组CgIL17-5的表达量在LPS刺激后的6h显著上调，是EGFP组的2.84±0.88(p＜0.01)倍，但是CgRel(长牡蛎中NF-κB的同系物)的核转位水平在两组之间未见显著性变化差异。结果表明在LPS刺激下，CgPDCD4可显著抑制长牡蛎血淋巴细胞中CgIL17-5mRNA表达。
3.长牡蛎在干露条件下，CgPDCD4mRNA表达在早期未见显著变化，在干露胁迫后第三天，开始显著上调并达到峰值，为空白组的3.91±0.91(p＜0.01)倍。将CgPDCD4转染至HEK293T细胞中，发现转染后的24h，CgPDCD4转染组对caspase-3和caspase-8的底物水解水平相比于空载组明显提高(p＜0.05)，结果表明CgPDCD4可响应干露胁迫并显著促进caspase蛋白的激活。
综上研究结果表明，长牡蛎CgPDCD4分子在进化上高度保守，其蛋白含有典型的MA-3结构域和RKR基序。CgPDCD4能在免疫应答后期下调表达，调节炎症因子CgIL17-5的合成，但其介导的具体合成机制与脊椎动物同源物存在差异。CgPDCD4能响应干露环境的胁迫，促进caspase蛋白酶的活化并调节细胞凋亡。研究结果初步阐明了长牡蛎中PDCD4在固有免疫应答中所起的调节作用，为进一步揭示无脊椎动物的细胞因子合成和炎症调节机制提供了重要的的理论依据。