程序性细胞死亡是由基因决定的、进化上保守的、以选择性去除机体多余细胞为目的的多细胞生物重要生命过程。因其发生机制不同，可分为细胞凋亡、自我吞噬、程序性坏死三种主要模式。在细胞凋亡中，Bcl-2家族蛋白是内源路径的核心调控者，其相对活动水平直接调节线粒体外膜的通透性。其中，促凋亡BH3-only蛋白Bid，在凋亡信号刺激下被酶切激活，移位至线粒体外膜进而激活Bax或Bak，使其在线粒体外膜聚集而形成孔道。　　近年来，一些研究显示tBid自身亦可引发线粒体外膜及溶酶体膜透化。研究表明，tBid在没有其他蛋白辅助的情况下就足以引发溶酶体膜的透化，并且检测到了溶酶体中组织蛋白酶B的泄露，而这一现象同样出现在Bax和Bak双敲除的细胞中。研究者指出磷脂酸(phosphatidic acid，PA)是tBid与类溶酶体膜作用引发其透化的桥梁分子。然而至今有关tBid能否在磷脂膜上形成“孔道”使得细胞器内容物泄露仍存争议。为明确tBid能否引发类溶酶体膜透化，利用已广泛用于蛋白与磷脂膜相互作用研究的巨型单层囊泡(giant unilamellar vesicles，GUVs)来模拟细胞器膜，在单囊泡层次直接观测tBid与磷脂膜的作用效果。为进一步研究tBid与类溶酶体膜相互作用引发磷脂膜透化的分子机制以及离子强度对tBid蛋白膜上构象的影响，我们利用本研究组提出的表面诱导荧光衰逝技术在单分子水平上进行探索。表面诱导荧光衰逝技术，充分利用了氧化石墨烯的荧光淬灭效应，对感兴趣的位点进行荧光标记后，便可将位点的入膜深度信息转换为荧光分子的相对光强。方法简单，易操作，仅需普通的单分子荧光成像设备便可实现探测。其纵向分辨率高，可达亚纳米级。结合单颗粒追踪，可实现对标记位点的三维运动分析。这一方法的发展即是为了在单分子水平上研究膜蛋白与磷脂膜的相互作用问题。　　结合单囊泡层次的染料泄露、集体脂质体染料泄露以及单分子荧光方法等多种实验手段，我们发现tBid可引起含20％DOPA的类溶酶体膜发生透化，形成小“孔道”，并且引发类溶酶体膜透化的分子机制为其在膜上逐步形成寡聚体。　　利用表面诱导荧光衰逝技术我们发现tBid单体一旦吸附上膜，便在曝光时间内迅速稳定在一个表浅的插膜状态。80、140及181残基贴附在磷脂膜表面，而166残基略插入膜中，入膜深度为0.6±0.3nm。即H3螺旋与磷脂膜相互作用结合在膜表面，疏水核心H6和H7两螺旋浅插入膜中。随着tBid在膜上逐渐累积形成小的寡聚体，80残基进入溶液环境，而166残基经缓慢的构象动态变化后进一步深入插膜，入膜深度可达2.0±0.4nm，140及181残基仍稳定在磷脂膜表面。表明H3螺旋在小的寡聚体形成时构象发生明显变化，进入溶液环境，而H6和H7两螺旋经缓慢构象变化入膜更深。　　当tBid继续在磷脂膜上累积聚集形成更大的寡聚体，80、166、181各残基均在三个甚至四个态间剧烈运动，频繁切换，且每个残基均可短暂稳定在磷脂膜下半层深处，表明多个螺旋均发生了剧烈的动态构象变化。虽然tBid无静态跨膜区，然而其可通过多结构域的频繁的剧烈构象变化实现动态跨膜。我们认为此动态跨膜即为tBid引发类溶酶体膜透化的分子机制。进一步，结合本论文实验结果及前人成果，提出tBid在类溶酶体膜上形成“孔道”的模式符合环形孔模型。　　不同离子强度条件的实验结果表明，离子强度对H3螺旋在膜上的构象产生了较大影响，却并不影响tBid疏水核心区域的单体入膜深度及tBid蛋白膜上吸附量。　　综上所述，在单囊泡水平证实了tBid可引发类溶酶体膜透化，并在单分子水平揭示了其引发类溶酶体膜透化的分子机制为在膜上逐步形成寡聚体。分析了tBid与类溶酶体膜作用过程的构象变化细节，提出了tBid寡聚动态跨膜成孔分子机制，以及tBid在磷脂膜上形成“孔道”的模式符合环形孔模型。发现了离子强度对tBid膜上构象的影响。