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远志皂苷元（Senegenin,SEN）是一种从我国传统中药远志（Polygala tenuifolia）中提取的活性成分,具有保护线粒体、抵抗神经元死亡的作用。Aβ1-42寡聚体具有神经毒性,可对线粒体造成严重损伤,并且与多种神经退行性疾病密切相关。细胞通过线粒体自噬（Mitophagy）对受损线粒体进行选择性清除,这一过程主要受PTEN诱导激酶1（PTEN-induced putative kinase 1,PINK1）/Parkin途径的调控。有研究报道远志皂苷可上调自噬通路上游调控因子AMPK（AMP-activated protein kinase）,促进自噬发生。此外,研究显示调控抗衰老经典基因Klotho,可增强自噬清除Aβ,改善细胞线粒体结构、功能及机体认知缺陷。胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor 1,IGF-1）可通过抑制AMPK激酶区域活性中心Thr172的磷酸化抑制其活性。由于Klotho能够通过负调控IGF-1间接调节自噬,作者推测SEN可通过线粒体自噬减轻Aβ1-42寡聚体引起的神经元损伤,该过程与Klotho/IGF-1/AMPK途径有关。本研究在活体实验中用SEN（3.6μg/g、7.2μg/g、14.4μg/g）对侧脑室注射Aβ1-42寡聚体的C57BL/6小鼠进行灌胃干预,在体外实验中用SEN（10μM、20μM、40μM、60μM）处理Aβ1-42寡聚体诱导损伤的小鼠海马神经元HT22细胞,结合线粒体自噬抑制剂环孢素（Cyclosporin A,Cs A）研究SEN能否通过线粒体自噬减轻Aβ1-42寡聚体诱导的神经元损伤;再利用慢病毒感染HT22过表达Klotho,探讨Klotho/IGF-1/AMPK途径在SEN诱导线粒体自噬中的作用,为深入了解SEN的神经保护作用和线粒体自噬调控机制提供更全面的理论支持,同时为中药远志防治神经退行性疾病的临床用药提供实验基础。本论文取得以下研究结果:1.Aβ1-42寡聚体导致小鼠海马神经元损伤。（1）体外实验中,30μM Aβ1-42寡聚体处理小鼠海马神经元HT22细胞24 h可显著降低细胞活力（p＜0.05）,增高乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）释放量（p＜0.05）,降低线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）（p＜0.05）,产生过量活性氧（Reactive oxygen species,ROS）（p＜0.05）,造成线粒体嵴模糊、结构混乱,并诱导细胞凋亡（p＜0.05）。（2）活体实验中,侧脑室注射Aβ1-42寡聚体可造成小鼠海马体神经元MMP显著下降（p＜0.05）,细胞凋亡率显著升高（p＜0.05）。2.SEN减轻Aβ1-42寡聚体引起的小鼠海马神经元损伤。（1）体外实验中,用不同浓度SEN处理Aβ1-42寡聚体诱导损伤的HT22细胞24 h,与诱导损伤组相比,20μM和40μM SEN处理组的细胞活力显著上升（p＜0.05）且MMP显著升高（p＜0.05）,20μM SEN可显著降低细胞凋亡率（p＜0.05）和ROS含量（p＜0.05）。（2）活体实验中,用不同剂量SEN灌胃干预侧脑室注射Aβ1-42寡聚体的小鼠,与诱导损伤组相比,14.4μg/g SEN干预组的小鼠海马体神经元MMP显著升高（p＜0.05）,细胞凋亡率显著降低（p＜0.05）。3.SEN诱导Aβ1-42寡聚体致损的小鼠海马神经元发生PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。（1）体外实验中,用20μM、40μM SEN处理Aβ1-42寡聚体致损的HT22细胞24 h,促进线粒体自噬体与线粒体自噬溶酶体的形成,自噬标志蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显著上调（p＜0.05）,自噬受体蛋白p62显著下调（p＜0.05）,引起全长型PINK1的蓄积（p＜0.05）和Parkin向线粒体的移位及线粒体与自噬体、线粒体与溶酶体的共定位,并且线粒体基质蛋白HSP60的表达下调（p＜0.05）。（2）活体实验中,与诱导损伤组相比,7.2μg/g SEN干预可使LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Parkin表达量显著上调（p＜0.05）;14.4μg/g SEN干预组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达量在显著升高的同时伴随着p62表达下降（p＜0.05）,HSP60的含量呈显著下降（p＜0.05）,14.4μg/g SEN干预组小鼠海马体神经元中形成线粒体自噬体。4.抑制线粒体自噬引起Aβ1-42寡聚体导致的HT22细胞损伤复现。（1）用5μM Cs A预处理Aβ1-42寡聚体致损的HT22细胞2 h后分别与20μM和40μM SEN联合处理24 h。与20μM SEN处理组相比,Cs A联合处理组中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和PINK1显著下降（p＜0.05）,p62显著上升（p＜0.05）;与40μM SEN处理组相比,Cs A联合处理组p62和HSP60含量显著上升（p＜0.05）,PINK1蓄积量明显降低（p＜0.05）;Cs A联合处理组无线粒体与自噬体、线粒体与溶酶体的共定位及线粒体自噬体的形成。（2）在线粒体网络动态变化中,与诱导损伤组相比,20μM和40μM SEN处理组细胞中的平均单独个体线粒体（Individuals）数量、线粒体网格（Networks）数量和线粒体面积（Mitochondrial Footprint）均显著增加（p＜0.05）;与SEN处理组相比,40μM SEN联合Cs A处理组细胞的平均单独个体线粒体数量和线粒体网格数量显著减少（p＜0.05）,20μM SEN联合Cs A处理组细胞内平均线粒体面积显著减少（p＜0.05）。（3）在细胞损伤相关检测中,与20μM SEN处理组相比,Cs A联合处理组中细胞活力再次出现显著下降（p＜0.05）,LDH释放量和ROS水平显著增加（p＜0.05）;与40μM SEN处理组相比,Cs A联合处理组的LDH释放量和ROS含量显著升高（p＜0.05）。5.Klotho/IGF-1/AMPK途径参与SEN诱导的线粒体自噬。与诱导损伤组相比,20μM SEN可显著提高Aβ1-42寡聚体诱导损伤的HT22细胞Klotho蛋白水平（p＜0.05）。过表达Klotho的Aβ1-42寡聚体致损HT22细胞与20μM和40μM SEN处理的Aβ1-42寡聚体致损HT22细胞中均发生自噬标志蛋白LC3与p62的表达变化,全长型PINK1蓄积,线粒体基质蛋白HSP60降低,表示线粒体自噬被激活,且IGF-1的表达量下降,AMPKα183/172的磷酸化水平升高。综上所述,本研究通过体内、体外实验探明了SEN通过诱导PINK1/Parkin介导的线粒体自噬拮抗Aβ1-42寡聚体导致的神经元损伤,并且此过程可能与SEN提高Klotho蛋白的表达、抑制IGF-1、增强AMPKα183/172的磷酸化有关。本研究首次从线粒体自噬角度揭示远志的药理活性,也对深入探究Klotho与线粒体自噬的关系提供了新的研究视角。