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研究背景:
早产儿视网膜病变(retinopathyofprematurity,ROP)是指发生在早产儿和低出生体重儿的一种增殖性视网膜病变,以往曾称为Terry综合征或晶状体后纤维增生症。近年来,我国ROP发病呈上升趋势,已经成为导致我国儿童盲的重要原因。目前ROP的治疗主要针对视网膜新生血管。对于多数患儿,治疗后可以使新生血管增殖病变停止而免于致盲。但是,仍有部分患儿使用抗新生血管药物治疗效果欠佳,即使在密切的随访观察和及时救治下,视网膜表面仍然会产生大量纤维增殖,并长入玻璃体腔,导致牵拉视网膜脱离。即使运用玻璃体切割手术解除纤维增殖膜对视网膜的牵拉,依然无法避免严重的视功能损害和视力丧失。与此同时,在其他眼底新生血管性疾病的研究中,如湿性年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变,在接受抗新生血管药物治疗后,均发生不同程度的视网膜下或视网膜前纤维增殖,甚至引起视网膜色素上皮细胞的撕裂或牵拉性视网膜脱离,严重影响疾病的预后。迄今为止,在世界范围内,对眼底新生血管性疾病的研究仍然集中在抗新生血管生成,对纤维化的研究较少。因此,研究如何抑制纤维增殖进程,从而提高眼底新生血管性疾病疗效,改善预后,最大限度减少ROP导致的视力严重损害,对于消除儿童盲具有重要意义。
研究发现纤维组织增殖的发生与发展是一个复杂的过程,受多种因素综合调控,多种细胞因子在纤维增殖膜中起着一定作用。在此过程中,碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)与纤维组织增殖关系最为密切,同时促进成
纤维细胞和血管内皮细胞增殖,是血管损伤后引起新生血管及纤维增殖膜形成的重要细胞因子。而在视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium,RPE)分泌多种细胞因子中就包括bFGF。在增生性玻璃体视网膜病变的研究中,报道了通过拮抗bFGF的作用,从而阻断了成纤维细胞生长。而在肺纤维化研究领域以及在组织修复的研究中,也对通过中和bFGF的作用,阻断其刺激成纤维细胞生长进行了相关报道。但在ROP纤维增殖的过程中,是否在缺氧的诱导下,通过RPE细胞引起bFGF分泌增加,从而促进成纤维细胞的增殖、分化与移行,这些都需要进一步验证。
研究目的:
本研究拟通过低氧浓度体外培养RPE细胞,模拟组织缺氧状态,研究缺氧对RPE细胞bFGF表达的影响,以及通过对RPE细胞上清液与人脉络膜成纤维细胞共培养,并进行相关条件因素干预,探讨bFGF与成纤维细胞增殖、分化和移行的关系。研究结果将为ROP纤维化可能的发病机制提供基础。
研究方法:
(1)缺氧条件下体外培养hRPE细胞,按不同缺氧时间分组,同时设立正常对照组,采用流式细胞技术检测hRPE细胞凋亡情况,Q-PCR检测hRPE细胞内bFGF与VEGF的mRNA表达量,Elisa检测hRPE细胞上清液bFGF和VEGF的蛋白分泌量。(2)hRPE细胞上清液与hOCF细胞体外共培养,按不同干预条件分组,同时设立正常对照组,通过流式细胞技术、CCK8细胞生长曲线、Transwell细胞迁移实验,对bFGF与成纤维细胞增殖、分化和移行的关系进行分析。
研究结果:
(1)流式细胞检测结果显示,随着缺氧时间延长,正常hRPE细胞逐渐减少,早期及晚期细胞凋亡比例均呈上升趋势。Q-PCR检测结果显示,bFGF和VEGFmRNA表达量均随缺氧时间延长而增加,至24h达到峰值(bFGF1.35±0.17,VEGF2.92±0.22),36h开始回落,但bFGFmRNA表达量在72h仍高于基础表达量,而VEGFmRNA表达量在36h已经接近基础表达量,并在72h低于基础表达量(p<0.05)。Elisa检测结果显示,hRPE细胞上清液中bFGF和VEGF的蛋白分泌量均随缺氧时间延长而增加,至24h达到峰值(bFGF177.86±3.89pg/mL,VEGF660.3±13.86pg/mL),36h开始回落,但仍高于基础分泌量(p<0.05)。(2)流式细胞检测结果显示,hRPE共培养组、hRPE+Anti-VEGF组及bFGF单因素对照组的正常细胞存活比例均在85%以上,细胞总体凋亡比例均较少。其中,bFGF单因素对照组正常细胞存活比例高达98.6%,而hRPE+Anti-VEGF组的正常细胞存活比例也接近95%。CCK8细胞生长曲线结果表明hRPE共培养组、hRPE+Anti-VEGF组及bFGF单因素对照组的细胞持续增长状态可维持时间长于正常对照组,且增长速率也高于正常对照组(p<0.05)。Transwell细胞迁移实验结果表明hRPE+Anti-VEGF组及bFGF单因素对照组细胞迁移能力均较正常对照组增加(p<0.05)。
研究结论:
(1)RPE细胞在缺氧24h内,机体通过调控部分RPE细胞发生凋亡以适应环境应激,从而使其他未凋亡的RPE细胞存活并继续执行生理功能。但当缺氧状态持续存在时,RPE细胞损伤逐渐加重,以致代偿失调。(2)缺氧导致RPE细胞中bFGF和VEGF表达水平同步增加并产生协同作用。(3)在持续缺氧后期,VEGF表达水平显著下降,bFGF仍处于高表达水平。(4)bFGF表达增高可以促进hOCF持续快速增殖,且显著增强hOCF细胞的迁移能力。
早产儿视网膜病变(retinopathyofprematurity,ROP)是指发生在早产儿和低出生体重儿的一种增殖性视网膜病变,以往曾称为Terry综合征或晶状体后纤维增生症。近年来,我国ROP发病呈上升趋势,已经成为导致我国儿童盲的重要原因。目前ROP的治疗主要针对视网膜新生血管。对于多数患儿,治疗后可以使新生血管增殖病变停止而免于致盲。但是,仍有部分患儿使用抗新生血管药物治疗效果欠佳,即使在密切的随访观察和及时救治下,视网膜表面仍然会产生大量纤维增殖,并长入玻璃体腔,导致牵拉视网膜脱离。即使运用玻璃体切割手术解除纤维增殖膜对视网膜的牵拉,依然无法避免严重的视功能损害和视力丧失。与此同时,在其他眼底新生血管性疾病的研究中,如湿性年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变,在接受抗新生血管药物治疗后,均发生不同程度的视网膜下或视网膜前纤维增殖,甚至引起视网膜色素上皮细胞的撕裂或牵拉性视网膜脱离,严重影响疾病的预后。迄今为止,在世界范围内,对眼底新生血管性疾病的研究仍然集中在抗新生血管生成,对纤维化的研究较少。因此,研究如何抑制纤维增殖进程,从而提高眼底新生血管性疾病疗效,改善预后,最大限度减少ROP导致的视力严重损害,对于消除儿童盲具有重要意义。
研究发现纤维组织增殖的发生与发展是一个复杂的过程,受多种因素综合调控,多种细胞因子在纤维增殖膜中起着一定作用。在此过程中,碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)与纤维组织增殖关系最为密切,同时促进成
纤维细胞和血管内皮细胞增殖,是血管损伤后引起新生血管及纤维增殖膜形成的重要细胞因子。而在视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium,RPE)分泌多种细胞因子中就包括bFGF。在增生性玻璃体视网膜病变的研究中,报道了通过拮抗bFGF的作用,从而阻断了成纤维细胞生长。而在肺纤维化研究领域以及在组织修复的研究中,也对通过中和bFGF的作用,阻断其刺激成纤维细胞生长进行了相关报道。但在ROP纤维增殖的过程中,是否在缺氧的诱导下,通过RPE细胞引起bFGF分泌增加,从而促进成纤维细胞的增殖、分化与移行,这些都需要进一步验证。
研究目的:
本研究拟通过低氧浓度体外培养RPE细胞,模拟组织缺氧状态,研究缺氧对RPE细胞bFGF表达的影响,以及通过对RPE细胞上清液与人脉络膜成纤维细胞共培养,并进行相关条件因素干预,探讨bFGF与成纤维细胞增殖、分化和移行的关系。研究结果将为ROP纤维化可能的发病机制提供基础。
研究方法:
(1)缺氧条件下体外培养hRPE细胞,按不同缺氧时间分组,同时设立正常对照组,采用流式细胞技术检测hRPE细胞凋亡情况,Q-PCR检测hRPE细胞内bFGF与VEGF的mRNA表达量,Elisa检测hRPE细胞上清液bFGF和VEGF的蛋白分泌量。(2)hRPE细胞上清液与hOCF细胞体外共培养,按不同干预条件分组,同时设立正常对照组,通过流式细胞技术、CCK8细胞生长曲线、Transwell细胞迁移实验,对bFGF与成纤维细胞增殖、分化和移行的关系进行分析。
研究结果:
(1)流式细胞检测结果显示,随着缺氧时间延长,正常hRPE细胞逐渐减少,早期及晚期细胞凋亡比例均呈上升趋势。Q-PCR检测结果显示,bFGF和VEGFmRNA表达量均随缺氧时间延长而增加,至24h达到峰值(bFGF1.35±0.17,VEGF2.92±0.22),36h开始回落,但bFGFmRNA表达量在72h仍高于基础表达量,而VEGFmRNA表达量在36h已经接近基础表达量,并在72h低于基础表达量(p<0.05)。Elisa检测结果显示,hRPE细胞上清液中bFGF和VEGF的蛋白分泌量均随缺氧时间延长而增加,至24h达到峰值(bFGF177.86±3.89pg/mL,VEGF660.3±13.86pg/mL),36h开始回落,但仍高于基础分泌量(p<0.05)。(2)流式细胞检测结果显示,hRPE共培养组、hRPE+Anti-VEGF组及bFGF单因素对照组的正常细胞存活比例均在85%以上,细胞总体凋亡比例均较少。其中,bFGF单因素对照组正常细胞存活比例高达98.6%,而hRPE+Anti-VEGF组的正常细胞存活比例也接近95%。CCK8细胞生长曲线结果表明hRPE共培养组、hRPE+Anti-VEGF组及bFGF单因素对照组的细胞持续增长状态可维持时间长于正常对照组,且增长速率也高于正常对照组(p<0.05)。Transwell细胞迁移实验结果表明hRPE+Anti-VEGF组及bFGF单因素对照组细胞迁移能力均较正常对照组增加(p<0.05)。
研究结论:
(1)RPE细胞在缺氧24h内,机体通过调控部分RPE细胞发生凋亡以适应环境应激,从而使其他未凋亡的RPE细胞存活并继续执行生理功能。但当缺氧状态持续存在时,RPE细胞损伤逐渐加重,以致代偿失调。(2)缺氧导致RPE细胞中bFGF和VEGF表达水平同步增加并产生协同作用。(3)在持续缺氧后期,VEGF表达水平显著下降,bFGF仍处于高表达水平。(4)bFGF表达增高可以促进hOCF持续快速增殖,且显著增强hOCF细胞的迁移能力。