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目的:天然彩色棉是一种纤维成熟吐絮时自身具有颜色的棉花。天然彩色棉纤维作为一种环境友好型材料,其织物具有无化学残留、亲肤、抗菌等优良性能,市场潜力和经济效益很高。但是天然彩色棉纤维颜色单调,色牢度和色饱和度低的问题限制了其发展。由于缺乏除棕色和绿色之外的其他彩色棉种质资源,无法用常规育种手段改良彩色棉品种。因此,明确纤维色素合成的代谢-转录调控网络,挖掘控制天然彩色棉纤维色素合成及调控基因,对天然彩色棉纤维品质和色泽品质改良具有重要的意义。方法:本研究利用转录组和代谢组学方法对绿色棉及其近等基因系白色棉12、18和24 DPA纤维的转录物和代谢物进行比较;对绿色棉纤维色素合成的核心基因Gh4CL的家族成员进行全基因组鉴定和生物信息学分析,并对在绿色棉纤维中表达的Ⅰ类和Ⅱ类Gh4CL进行酶动力学分析;构建Gh4CL基因CRISPR/Cas9基因编辑敲除和过表达载体,遗传转化绿色棉,对获得的再生植株进行鉴定和分析。结果和结论:(1)绿色棉及其近等基因系白色棉12、18和24 DPA纤维的代谢组学研究发现,在绿色棉纤维(GCF)和白色棉纤维(WCF)中共有2047个非冗余差异代谢物,富集到80条通路,包括苯丙烷通路和角质,软木脂及蜡的生物合成通路。苯丙烷通路的大多数代谢物,例如芥子醛、咖啡酸、阿魏酸、无色花青素和黄酮醇等,在GCF中的含量高于WCF,这与调控这些代谢物生物合成相关基因的显著上调相一致。结果表明,绿色棉纤维中主要色素物质包括羟基肉桂酸及其衍生物和黄酮醇类物质。(2)转录组测序方法比较GCF和WCF在三个发育时期的差异表达基因,并通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)挖掘与GCF色素沉着相关的基因模块。在与纤维颜色或时间点共表达的16个基因模块中,与G24相关的蓝色模块(即24 DPA时的GCF)尤为重要,模块中大部分基因在G24时期显著上调。在蓝色模块的基因中,共鉴定出56个核心基因,包括两个在GCF色素沉着中发挥重要作用的Gh4CL基因(Gh4CL12和Gh4CL30)。我们的结果为GCF色素沉着的潜在机理提供了新颖的见解,并为开发具有稳定纤维颜色的绿色棉提供了线索。(3)在陆地棉基因组中共鉴定到34个4CL成员,随机的分布在22条染色体上。系统发育分析表明Gh4CL可分为ClassⅠ、ClassⅡ和ClassⅢ(4CL-like)三组。基因结构分析显示,与其他植物一样,陆地棉中的4CL基因也具有多内含子和多外显子结构,且同一分组的成员具有相似的基序和外显子-内含子排列,说明它们可能在功能上具有相似性。(4)ClassⅠ和ClassⅡ中Gh4CL基因表达模式分析发现,Gh4CL5和Gh4CL18在纤维中不表达,Gh4CL6和GhCL24,Gh4CL12和Gh4CL30在绿色棉24 DPA纤维中优势表达,而Gh4CL7和Gh4CL25主要在绿色棉18DPA纤维中表达,Gh4CL20则主要在12 DPA纤维中表达。酶动力学分析表明:Gh4CL20显示出对4-香豆酸的底物偏好性,但其转化率很低;Gh4CL24表现出对阿魏酸的底物偏好性;Gh4CL25表现出对阿魏酸和咖啡酸的底物偏好性,对4-香豆酸和肉桂酸催化活性较低;Gh4CL30表现出对阿魏酸和咖啡酸的底物偏好性。Gh4CL20、Gh4CL24、Gh4CL25和Gh4CL30均不能催化芥子酸。推测Gh4CL30可能参与咖啡酰和阿魏酰残基代谢并且与绿色棉纤维色素合成相关,Gh4CL20参与类黄酮化合物合成,且上述四个Gh4CL基因可能具有不同的生物学功能。(5)通过农杆菌介导的棉花遗传转化方法获得了GhCL20、GhCL24、GhCL25和GhCL30的转基因植株。Gh4CL20基因编辑植株表现为花瓣颜色变白,柱头伸长,花粉数目减少,植株不育;Gh4CL20过表达植株表现为花药颜色变红,纤维颜色不变。对Gh4CL20基因编辑植株和野生型植株花瓣进行转录组测序和代谢组分析,在Gh4CL20基因编辑植株花瓣中的类黄酮化合物含量较野生型植株花瓣中低,且类黄酮生物合成途径的基因(PAL、C4H、CHS、F3H、DFR、ANR、FLS、ANS和UFGT)表达量降低。以上结果表明Gh4CL20基因参与棉花花中类黄酮的生物合成,并与棉花的育性相关。GhCL24和GhCL25基因编辑敲除植株纤维颜色较野生型没有显著变化。Gh4CL30基因编辑敲除植株在表型上较野生型没有显著表型差异,纤维没有发生肉眼可见的颜色变化,表明Gh4CL30在绿色棉中存在功能冗余基因。