脑血栓形成(Cerebral atherosclerotic thrombosis)是最常见的脑血管疾病之一，随着人们生活水平的提高，它的发生率也呈现逐渐增高的趋势。脑血栓形成后会引起包括脑梗塞等多种严重并发症，治疗效果差，病残率高，严重影响了人们的生活质量，所以必须采取有效措施来预防脑血栓形成。然而，目前只有抗血小板聚集药物对预防血栓形成有一定疗效，但其有效率也仅达20-30％，因此有必要开发其他有效预防脑血栓形成的药物。 组织因子(Tissue factor,TF)是止血和血栓形成的重要调节因子。生理情况下，内皮细胞不表达TF基因，从而保证血液流动通畅，维持血液循环功能正常。但在病理状态下，内皮细胞功能障碍时，会引起TF基因异常表达，使内皮细胞由抗凝状态转变为促凝状态。目前研究发现，内皮细胞TF基因的异常表达与动脉粥样硬化等心血管疾病血栓性并发症有关而日益受到重视。 研究发现脑血栓常发生在脑血管相对狭窄、弯曲、分叉或动脉粥样硬化斑块的溪谷处，这提示血流动力学因素尤其是切应力(shear stress，ss)在脑血栓形成与分布有着极其重要的作用，进一步研究发现切应力是通过血管内皮细胞(Endothelial cell，EC)的介导而对血管壁产生作用。研究表明随着局部切应力显著改变，诱导内皮细胞表达TF，是触发局部血管内血栓形成的起始及发展的关键。因此抑制切应力诱导的TF异常表达是预防脑血栓形成的主要途径之一。 人TF基因定位于1号染色体(1p21～1p22)，cDNA全长2.3kb，位于TF基因启动子区-111～+15bp中的3个sp1／Egr-1位点是核转录因子sp1和Egr-1的特异性结合序列，即切应力反应元件(shear stress responsive element，SSRE)，是切应力诱导启动TF基因转录的特异性调节元件。但切应力如何介导核转录因子与SSRE的作用尚无定论。目前观点认为，采取有效措施阻断SSRE激活，可以达到抑制切应力诱导的TF基因表达的目的。而反基因技术的发展为抑制SSRE的激活提供了有效手段。 利用反基因技术合成的形成三股螺旋的寡核苷酸(Triple helix-forming oligonucleotide，TFO)，经过修饰后可直接透过细胞膜进入靶位点，能够与线状、松弛线状及超螺旋质粒DNA或染色体DNA结合形成三股螺旋结构，阻止靶DNA与调节第三军医大学硕士学位论文蛋白(如多聚酶、核转录因子)结合，从而阻碍靶基因转录、复制及表达。由于TFO与DNA本身特异结合而不是与其转录产物mRNA结合，具有较高的抑制基因转录效果。本系列研究前期工作己针对TF基因启动子区ssRE中3个spl尼gr一1位点的DNA序列设计合成TFo，并进行硫代磷酸醋修饰。经凝胶电泳迁移率改变法(Electr叩horeticmobility shirt analysis，EMsA)初步筛选出3条Spl龙爹z位点亲和性较高的反向硫代TFo(antiPrarallel一PhosPhorothioated TFO，aPTFO)，即T14GTa一Ps、T21GTa一ps及T巧GTa一Ps，它们分别针对3个SPI/Egr一1位点的第1位点、第2位点和第3位点。但其疗效尚需进一步验证。与此同时，由于目前对于切应力如何介导转录因子与TF基因SSRE的作用尚不清楚，有必要开展相应的研究。 针对上述问题，本课题拟:l)通过报告基因法和RT一PCR法评价前期合成的3条apTFOs对切应力诱导TF基因表达的抑制效果。2)通过凝胶电泳迁移率改变法(EMsA)和w℃stern印迹法(western blot，wB)对切应力及TFo调节TF基因表达进行初步探讨。 本课题的研究包括两部分: 第一部分:TFO抑制切应力诱导TF基因表达的效果评价 (l)报告基因法:分别取不同浓度的3条apTF0s及其相应的顺向硫代TFo(prarallel一phosphorothioated TFo，pTFo)，经脂质体法将其与荧光素酶报告基因共转染人脐静脉内皮细胞株Ecv304细胞24h，再接受12dy可cmZ切应力作用8h，评价TFO对人脐静脉内皮细胞TF基因表达的抑制效果。以不加TFO的质粒转染为阳性对照。荧光素酶活性检测结果表明，apTFo对TF基因表达抑制作用呈剂量依赖性。其中0.5林mol/L TZIGTa一ps、T15GTh一ps及T14GTa一ps对TF基因诱导表达的抑制率分别为70.3%、55.8%、45.5%，而pTFo对TF基因表达无抑制作用。结果还发现，单独应用TZ 1 GTa一Ps对TF基因表达的抑制效果，与3种aPTFOs混合物对TF基因的抑制效果相比，无显著性差异(P>0.05)。 (2)RT一PCR法:分别取不同浓度的3条apTFos及其相应的pTFo，与人脐静脉内皮细胞株Ecv304细胞共孵育24h后，通过平行板流动腔施以12dy可cmZ切应力，采用RT一PCR法检测TF基因表达水平，评价TFO对人脐静脉内皮细胞TF基因表达的影响。以不加TFO的质粒转染为阳性对照。RT一PCR具有与实验一(1)相似的结果。 综上结果表明:山本研究前期合成的3条叩TFOs均能较好的抑制TF基因表达;②其中针对第二位点的T21GTa一Ps具有主导地位，单独应用它来封闭第2个Spl肥gr一1位点，即可达到有效抑制TF基因表达的目的。第三军医大学硕士学位论文 第二部分:切应力及TFO调节TF基因表达机制的初步探讨 (1)凝胶电泳迁移率改变法(E MSA):对静止组、切应力组(Ss组)和TFO组检测发现:①静止组、55组和apTFO组细胞核蛋白与SPI探针的结合量无显著性差异(P>0.05)，应用2倍S