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类枯草杆菌蛋白酶（Subtilisin-like protease）功能多样,是研究最为深入的蛋白酶家族之一,其常为无活性的酶原形式,通过分子内或分子间的剪切转化为成熟酶,从而行使其功能。孢子发芽是微孢子虫独特的侵染方式,其分子机制是微孢子虫研究领域近几十年都未攻克的科学难题。孢子发芽时,孢壁较薄的极帽区结构被破坏,在胞内膨压的协同作用下,导致极管迅速弹出。前期研究发现家蚕微粒子虫（Nosema bombycis）的类枯草杆菌蛋白酶Nb SLP1定位于成熟孢子的两极,成熟酶定位于极帽区及弹出极管的前端,可能在发芽过程中发挥酶解作用,促进极管弹出。本研究以解析类枯草杆菌蛋白酶SLP1的成熟过程为目标,比较分析了家蚕微粒子虫（N.bombycis,N.b）、东方蜜蜂微孢子虫（N.ceranae,N.c）、海伦脑炎微孢子虫（Encephalitozoon hellem,E.h）、兔脑炎微孢子虫（E.cuniculi,E.c）、肠脑炎微孢子虫（E.intestinalis,E.i）的SLP1的结构域和三维结构;验证了5种微孢子虫SLP1预测信号肽的分泌功能;采用原核表达系统明确了5种微孢子虫的SLP1在去掉信号肽后能够自剪切产生成熟酶;以家蚕微粒子虫的Nb SLP1为模型,采用质谱鉴定及位点突变等方法鉴定了其自剪切位点和活性位点,阐明了微孢子虫SLP1成熟的分子过程。具体结果简述如下:1、微孢子虫SLP1的序列分析及信号肽活性鉴定利用生物信息学分析软件及相关网站,将5种微孢子虫的SLP1同源序列进行比较分析。5种微孢子虫的SLP1均由信号肽、前肽和催化结构域组成,保守性较高。SLP1活性结构域的催化三联体分别预测为D193H224S413（Nb SLP1）、D155H187S374（Nc SLP1）、D148H180S386（Ec SLP1）、D148H180S386（Eh SLP1）、D148H180S386（Ei SLP1）,并且前肽I9抑制结构域延伸至SLP1的活性中心部位。利用信号肽捕获系统验证了微孢子虫SLP1预测的信号肽序列具有分泌功能,表明SLP1为分泌型蛋白酶,可能被微孢子虫分泌至细胞膜表面或细胞外完成成熟过程进而发挥功能。2、微孢子虫SLP1的剪切活化与酶活性检测利用大肠杆菌Escherichia coli（BL21）表达系统对海伦脑炎微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、肠脑炎微孢子虫、东方蜜蜂微孢子虫的Pro-SLP1进行原核表达,明确了4种微孢子虫的Pro-SLP1能够在大肠杆菌中发生剪切产生成熟酶。构建SLP1去信号肽序列的重组载体,转化大肠杆菌,采用0.2 m M IPTG,16℃,100 rpm的条件诱导20-24 h,获得Pro-Eh SLP1、Pro-Ec SLP1、Pro-Ei SLP1、Pro-Nc SLP1可溶表达蛋白。蛋白质电泳结合免疫印迹分析发现,4种微孢子虫的Pro-SLP1在～55 k Da附近;抑制结构域I9在15 k Da附近;包含S8活性结构域的成熟酶在4种微孢子虫中有些许差异。Eh SLP1的成熟酶在～40 k Da处有临近的两条蛋白条带,Ec SLP1和Ei SLP1的成熟酶在～40 k Da处有单一蛋白条带,Nc SLP1的成熟酶在～35 k Da处。经亲和层析和透析除盐后,利用酪蛋白酶谱法验证蛋白酶的活性,显示酶活较低。3、家蚕微粒子虫Nb SLP1自剪切和活性位点鉴定基于前述研究发现的5种微孢子虫的SLP1均能被剪切产生成熟酶,本部分以Nb SLP1为模型,阐释微孢子虫SLP1成熟的分子过程。通过构建具有信号肽序列的全长FL-Nb SLP1原核表达载体,证明了信号肽序列被切割是蛋白酶后续发生剪切活化的前提。利用LC/MS-MS质谱鉴定表明Nb SLP1在大肠杆菌中发生了被剪切了两次。实验室前期研究通过N端测序及点突变技术鉴定了Nb SLP1的第一个剪切位点。本研究针对已鉴定的剪切位点及第2个可能的剪切位点构建单/双突变体蛋白,证明2个位点MRIA104↓D105FNL和FIMA124↓D125FNL均参与SLP1的剪切活化过程,且MRIA104↓D105FNL发挥主要作用。通过分别构建催化三联体D193A、H224A和S413A突变体,发现SLP1突变体蛋白酶的剪切效率均受到不同程度的抑制,明确了D193H224 S413构成Nb SLP1的酶活性中心,通过自剪切活化,是Nb SLP1成熟的关键。综上,本研究结合5种微孢子虫SLP1的序列及结构具有保守性,通过信号肽鉴定及表达分析等证明了微孢子虫SLP1的信号肽具有分泌活性,其成熟以信号肽切割为前提,通过蛋白酶原的自剪切产生成熟酶。研究以家蚕微粒子虫的类枯草杆菌蛋白酶Nb SLP1为模型,利用质谱鉴定结合蛋白突变体的构建及检测,阐明了Nb SLP1完成信号肽切割后,通过D193H224S413形成的酶活性中心,在MRIA104↓D105FNL和FIMA124↓D125FNL两个位点发生自剪切产生成熟酶的分子过程。