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本研究从环境分离到一株碱性蛋白酶产生菌,通过形态特征、生理生化和16SrRNA基因序列分析确定菌株的分类地位,并采用正交试验设计探讨其发酵改良血粉和豆粕饲用品质的效果,同时构建其碱性蛋白酶基因的表达质粒,对重组质粒表达条件和特性进行研究,并探索重组酶的部分酶学性质。1.碱性蛋白酶产生菌的分离和鉴定。为了筛选碱性蛋白酶产生菌并探讨其对蛋白质饲料的发酵效果,以肉粉厂表层土壤为菌株分离源,利用脱脂牛奶培养基分离和纯化蛋白酶产生菌,通过形态特征、生理生化和16S rRNA基因序列分析确定菌株的分类地位,此碱性蛋白酶产生菌与枯草芽孢杆菌亲缘关系最近,同源性为99.5%,故命名为枯草芽孢杆菌D-2。2.枯草芽孢杆菌D-2固态发酵蛋白饲料效果的研究。采用L9(33)正交设计研究筛选出的优势菌种的接种量(3%、6%和12%)、种子液培养时间(12h、24h和48h)和固态发酵时间(12h、24h和48h)3因素对发酵豆粕和血粉的影响。结果表明,其最优条件为接种量6%、种子液培养时间24h和发酵时间48h,在最优条件下,该菌固态发酵豆粕及血粉可显著增加小肽含量至17.06%和12.73%。枯草芽孢杆菌D-2(Bacillus subtilis strain D-2)所产的碱性蛋白酶能高效降解豆粕和血粉中的蛋白,提高豆粕和血粉的饲用品质。3.枯草芽孢杆菌D-2碱性蛋白酶基因的克隆、表达。为了建立高产的枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因表达体系,采用PCR方法从枯草芽孢杆菌D-2中扩增等到碱性蛋白酶基因,将其连入表达质粒pET-32a构建原核表达重组质粒pET-apr-D2。经测序、鉴定后,转化至大肠杆菌BL21构建成重组工程菌,并对该基因和编码蛋白进行同源性比较和诱导表达条件的研究。结果表明,碱性蛋白酶基因序列全长1149bp,编码382个氨基酸, SDS-PAGE显示融合蛋白分子质量为60.4kDa。在诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷浓度0.2mmol/L,诱导时间为4h,重组工程菌在27℃表达产物主要以可溶形式存在,37℃主要以包涵体形式存在。可溶性表达产物经测定具有碱性蛋白酶生物活性。4.重组菌碱性蛋白酶纯化及其酶学性质研究。为了研究重组酶盐析特性和酶学性质,发酵液经硫酸铵分级盐析和透析除盐纯化得粗酶并研究不同温度、pH条件和金属离子、化学试剂处理下的酶活。盐析曲线表明在硫酸铵浓度60%时发酵液中重组酶几乎完全析出,酶学性质研究表明该重组酶的最适反应温度为50℃,最适pH为10.5,具有较高的热稳定性,在pH8.0～12.0范围下都能保存较高的酶活,Ca2+与Mg2+对酶都有一定的激活作用,而Hg+、Ag+对酶有明显的抑制作用,苯甲基磺酰氟(PMSF)和二异丙基氟磷酸(DFP)对该酶具有强烈抑制作用。5.枯草芽孢杆菌D-2碱性蛋白酶的核酸和蛋白质结构分析。为了研究Bacillussubtilis strain D-2的碱性蛋白酶的编码基因和该酶蛋白质的生物信息学,本文使用NCBI数据库的不同程序、BioEdit软件、Ⅰ)NAstar软件、ProtScale程序、NetPhos2.0Server程序、scratch protein Predictor程序、TMHMM预测、Hopfield神经网络预测、NetTurnP1.0程序、CBS Prediction Servers程序、Pfam预测、SMART预测、PSORTb程序等,对核苷酸序列、碱基同源性和开放阅读框进行了分析,并将核酸序列翻译为氨基酸序列,预测和分析了蛋白质的一级结构、二级结构和三级结构,包括氨基酸序列分析、信号肽预测、疏水性分析、跨膜区分析、亚细胞定位、结构域预测和空间结构预测。结果表明,此蛋白酶的信号肽位置为前30个氨基酸的肽链,疏水性较高,含跨膜区,第30～382个氨基酸的肽链为胞外区,为分泌型蛋白酶,含有α螺旋、β折叠、p转角等结构域,并预测出了其空间结构。