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Aurora是一类独特的丝/苏氨酸激酶,主要参与调节细胞的有丝分裂和减数分裂。这个家族在人类有Aurora-A,Aurora-B和Aurora-C三个成员,它们主要参与中心体的功能调节,双极纺锤体的形成以及染色体的分离过程。人类Aurora激酶家族的A、B、C三个成员在多种恶性肿瘤中均显著上调表达,而且转基因实验证明Aurora-A对细胞具有转化作用,故被认为是一个原癌基因,与癌症发生有着密切的关系。这三个蛋白激酶在序列上非常相似,尤其是C端的催化区域高度保守,人Aurora-A和Aurora-B有71%的同源性。在催化区含有XRXTXXCGTX的激活环,是Aurora家族特异的保守基序。人Aurora-A和B催化区的晶体结构已被解析,三维结构显示这两个激酶的功能域高度保守。然而,三个Aurora激酶在N端的长度和序列相差较多,长度分别是128、64以及7个氨基酸,N端只在起始处的几个氨基酸是保守的,其余部分没有序列保守性,这提示三个激酶作用的方式和底物可能有所不同。
在早先的研究中我们发现Aurora-A的催化区(129-403aa)激酶活性要高于全长Aurora-A约4倍,所以推测Aurora-A的N端对于激酶活性可能具有一定的负调节作用。本文重点研究了N端对于激酶活性的作用,通过体内实验和体外实验均证明Aurora-A的N端可以抑制催化区的激酶活性,而且这种作用随着N端蛋白的逐渐增加呈现剂量依赖关系。由此我们证明Aurora-A的N端对于激酶活性确有负调控作用。
为了进一步研究Aurora-A的这种负调节机制,我们通过实验证实调节区和催化区可以相互作用,并且这种相互作用依赖于调节区的64-128aa和催化区的240-300aa。我们还通过空间结构模拟,识别了K99、K119、K250、D294Y295几个影响激酶活性的关键位点。还发现调节区可以通过抑制激活环内Thr288位的自磷酸化而产生负调节效应。
Aurora-A除了自身的调控作用外还可以被许多其他蛋白调控,其中TPX2是目前研究最透彻的一个,TPX2可以与Aurora-A的催化区结合,促使激活环发生变构效应,阻止PP1对Thr288位的水解作用,从而激活Aurora-A-Ajuba是又一个重要的Aurora-A激活蛋白,我们通过研究发现Ajuba的Lim结构域可以竞争性地结合Aurora-A的调节区,解除其对催化区的抑制作用,同时Ajuba的Prelim可以和催化区结合并被磷酸化,通过对催化区结构的稳定作用,提高了催化区激活环Thr288位的磷酸化程度,进而增强Aurora-A催化区的激酶活性。
此外我们在研究过程中利用EST同源克隆策略从人睾丸cDNA文库中克隆得到了一个新的人类含有LU结构域的基因LYPD7(LY6/PLAURdomaincontaining7),并对该基因的功能进行了初步分析。通过生物信息学分析显示该基因定位于染色体的2q22.3-23.3,其cDNA全长1600bp其中开放阅读框(ORF)长度624bp,编码207个氨基酸。RT-PCR分析结果显示LYPD7基因在睾丸、肺、胃和前列腺组织中高表达。在Hela细胞内的亚细胞定位显示,LYPD7主要定位于胞质中。通过信号通路的研究发现,在HEK-293T细胞内过量表达LYPD7,可以提高AP1(PMA)信号通路的转录活性。
综上所述,本文的主要研究结果是:首次发现了Aurora-A激酶具有自身负调节作用;首次解析了Ajuba激活Aurora-A的作用模式;研究结果加深了对于Aurora-A激酶活性调节方式的理解,同时对于筛选特异性抑制Aurora-A激酶活性的抗肿瘤小分子化合物,提供有指导价值的实验资料。