1,3-丙二醇生物合成新途径的构建

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1,3-丙二醇(1,3-PDO)是一种重要的化学物质,已经广泛应用于纺织品、树脂和药物等领域中,更重要的是,1,3-PDO可作为合成聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的单体。现有报道的以葡萄糖为底物生物法合成1,3-PDO的代谢途径多为甘油模块整合途径,需要添加昂贵的辅酶B12,增加了发酵成本,不利于1,3-PDO的规模化生产。本论文提出两条以葡萄糖为底物的生物合成新途径,并分别进行了模块化构建与优化,其中β-alanine途径无需添加辅酶B12且产量较高,研究结果总结如下:(1)β-alanine途径模块化构建。首先提出一条从葡萄糖生产1,3-PDO的非天然途径β-alanine pathway,无需添加辅酶B12。通过途径的模块化构建,实现了1,3-PDO的从头合成,产量为105.6 mg/L。接着进行模块化优化,包括限速步骤关键酶筛选、质粒拷贝数优化、N端标签和RBS协同优化(翻译水平)、启动子调控(转录水平)。优化后菌株BW 4-10产量达599.82 mg/L。(2)优化前体供应。确定β-alanine pathway关键前体为L-天冬氨酸/β-丙氨酸,对产生L-天冬氨酸的两条主要路线进行了分析择优,并在此基础上进行关键酶的筛选,菌株BW-tac-asp DH较对照菌株BW 4-10产量提高52.10%,达912.30 mg/L。此外为增加OAA供应,比较了分别强化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)与丙酮酸羧化酶(pyc)对产物合成的影响,经初步培养基优化后,对照菌株BW 4-10产量2.25 g/L,实验菌株BW 6-1产量最高为4.11 g/L,较对照菌株提高82.67%。(3)TCA循环弱化及竞争途径敲除。通过as RNA策略对TCA循环进行弱化,结果显示柠檬酸合酶的弱化对1,3-PDO的合成有促进作用,菌株BW-glt A5产量达3.51 g/L,较对照菌株BW 4-10提高56.00%。同时对L-天冬氨酸和β-丙氨酸的消耗途径进行了敲除,发现敲除met L的重组菌株能够提升产物产量,最高达3.64 g/L。(4)发酵优化。发酵优化包括培养基的主要成分,诱导剂的添加时间以及浓度和5 L发酵罐放大培养。最优的培养基主要成分组合为30 g/L葡萄糖、10 g/L yeast、5 g/L乙酸铵,同时最优的诱导条件为OD6002.0,IPTG终浓度为1.0 m M。利用菌株BW△met L-ppc-glt A5进行发酵,1,3-PDO产量为6.41 g/L,5 L发酵罐中产量为11.21 g/L,产率为0.21 g/g葡萄糖。(5)propionyl-Co A途径探究。对从葡萄糖生产1,3-PDO的非天然途径propionyl-Co A pathway进行了前期探究,通过底盘改造获得高产前体琥珀酸以及丙酸的大肠杆菌,琥珀酸产量达656.42 mg/L,丙酸产量达2.65 g/L。最后探究了限速步骤关键酶丙酰辅酶A脱氢酶的特性。
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