PRDX6介导NRF2调控HGFs炎症反应和铁死亡的相关机制研究

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背景:牙周炎是一种由菌斑微生物引起的牙周组织损伤的慢性炎症性疾病,主要病因是机体对菌斑刺激引起的炎症免疫反应。近年研究表明氧化损伤也在牙周组织破坏中发挥重要作用。过氧化物酶6(Peroxiredoxin 6,PRDX6)作为一种抗氧化酶可修复过氧化的细胞膜,在铁死亡中发挥调节作用。本研究主要探讨PRDX6在LPS诱导的人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)中炎症反应及铁死亡中发挥的作用及其机制。方法:1.分别收集健康牙龈组织和III期或IV期牙周炎患者的炎症牙龈组织标本,通过免疫组织化学和Western blotting检测PRDX6和核因子E2相关转录因子2(nuclear factor erythropoietin 2-related factor 2,NRF2)的表达。2.为探究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)在本实验中的最佳刺激的浓度,分别用不同浓度LPS(0,1,5,10μg/m L)刺激HGFs 12 h,通过RT-qPCR检测IL-6和TNF-α的表达,Western blotting和RT-qPCR检测PRDX6和NRF2的表达。分别用10μg/m L LPS刺激不同时间(0,12,24,48 h),通过RT-qPCR检测炎症因子IL-6和TNF-α的表达,Western blotting和RT-qPCR检测PRDX6和NRF2的表达。3.为探究LPS是否可以引起HGFs发生铁死亡,分别用不同浓度LPS(0,1,5,10μg/m L)刺激HGFs 12 h,用C11-BODIPY探针检测铁死亡标志物,即脂质过氧化物(lipid hydroperoxide,LOOH)的产量。随后加入铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1),通过CCK-8检测细胞活力,乳酸脱氢酶实验(lactate dehydrogenase,LDH)检测细胞毒力,C11-BODIPY探针检测LOOH,RT-qPCR和ELISA检测炎症因子IL-6和TNF-α的表达。4.为探究PRDX6在LPS诱导的HGFs中的作用,分别用PRDX6 si RNA和Control si RNA转染HGFs 48 h,通过Western blotting和RT-qPCR检测PRDX6的表达。用LPS(10μg/m L)刺激PRDX6沉默的HGFs 12 h,通过CCK-8检测细胞活力,LDH检测细胞毒性,RT-qPCR和ELISA检测IL-6和TNF-α,C11-BODIPY探针检测LOOH。5.为探究PRDX6的PLA2酶活性在LPS诱导的HGFs炎症反应和铁死亡中的作用,分别用LPS(10μg/m L)和PRDX6-PLA2抑制剂MJ33(5μM)刺激HGFs 12h,通过CCK-8检测细胞活力,LDH检测细胞毒性,RT-qPCR和ELISA检测炎症因子IL-6和TNF-α,C11-BODIPY探针检测LOOH。6.为探究NRF2通路在LPS诱导的HGFs中的作用,分别用LPS(10μg/m L)和NRF2抑制剂ML385(5μM)刺激HGFs 12 h,用CCK-8检测细胞活力,LDH检测细胞毒性,RT-qPCR检测NRF2和PRDX6的表达,RT-qPCR和ELISA检测IL-6和TNF-α,C11-BODIPY探针检测LOOH。结果:1.免疫组织化学和Western blotting结果显示PRDX6和NRF2在III期或IV期牙周炎组织中的表达降低。2.PRDX6和NRF2在不同浓度的LPS刺激12 h时表达上调且呈浓度依赖性。PRDX6和NRF2在LPS刺激12 h时至24 h时明显升高,在48 h时表达下调。3.LPS促进HGFs中LOOH的积累,加入铁死亡抑制剂Fer-1与LPS共同处理HGFs 12 h,LPS诱导的细胞毒性,炎症因子和铁死亡程度降低。4.与对照组细胞相比,PRDX6沉默HGFs的细胞活力在LPS处理后下降。PRDX6沉默不能增加HGFs的细胞毒性,炎症因子和LOOH水平。然而,PRDX6沉默提高LPS诱导的炎症因子和LOOH水平。5.用MJ33和LPS同时处理的细胞活性比LPS组增加,而细胞毒性、炎症因子和脂质过氧化物相对降低。6.与LPS组相比,ML385+LPS组的细胞活性降低。此外,ML385+LPS组的PRDX6和NRF2表达比LPS组下降,ML385处理提高了LPS诱导的细胞毒性,炎症因子和LOOH。结论:本研究表明,PRDX6作为一种抗氧化酶,可对LPS诱导的HGF炎症反应和铁死亡起保护作用。抑制PRDX6的PLA2酶活性可减轻牙龈成纤维细胞中的炎症反应和铁死亡。NRF2信号通路是一条经典的与氧化应激相关的信号通路,在牙龈成纤维细胞中调节PRDX6表达,并发挥保护作用。因此,这项研究为基于PRDX6和铁死亡的牙周炎机制提供了新的见解。
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