【摘 要】
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背景:耳蜗螺旋神经节神经元兴奋毒性是众多感音神经性聋的共同分子机制。抑制GABAA受体的应答是水杨酸钠致SGNs兴奋毒性的途径之一。研究表明,多巴胺受体第二家族（DR2）通过与神经元中的GABAA受体相互作用,减弱了GABAA受体的功能,促进神经元的兴奋毒性。其机制仍不明确,且GABAA受体的内吞作用与磷酸化水平密切相关,而蛋白激酶A是调节GABAA受体磷酸化水平的主要蛋白激酶,据此提出研究假设:
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背景:耳蜗螺旋神经节神经元兴奋毒性是众多感音神经性聋的共同分子机制。抑制GABAA受体的应答是水杨酸钠致SGNs兴奋毒性的途径之一。研究表明,多巴胺受体第二家族（DR2）通过与神经元中的GABAA受体相互作用,减弱了GABAA受体的功能,促进神经元的兴奋毒性。其机制仍不明确,且GABAA受体的内吞作用与磷酸化水平密切相关,而蛋白激酶A是调节GABAA受体磷酸化水平的主要蛋白激酶,据此提出研究假设:DR2可通过PKA依赖的磷酸化途径介导水杨酸钠对GABAA受体的调节作用。目的:观察在水杨酸钠对SD乳鼠SGNs的干预后,DR2及PKA活动对GABAA受体的mRNA和蛋白表达的影响,探索水杨酸钠对SGNs造成兴奋毒性损伤的作用机制。方法:SGNs原代培养,利用细胞免疫荧光技术,观察SGNs中GABAA受体的β1亚基（GABRβ1）、多巴胺受体第2家族（DRd2）的表达;用qPCR技术和WB技术,观察水杨酸钠干预前后,DR2及PKA活动的情况下,GABRβ1mRNA、蛋白质水平的变化。结果:（1）SGNs的细胞胞体及突起均有GABRβ1、DRd2的表达:（2）5m M水杨酸钠的作用下,qPCR检测到GABRβ1亚基的mRNA表达与空白对照组相比增加了66.5%（P＜0.05）,而DRd2的mRNA表达与空白对照组相比增加了55.5%（P＜0.05）。Western Blot结果显示:DR2激动剂（Quinpirole）、水杨酸钠及水杨酸钠和DR2激动剂（Quinpirole）组作用后,SGNs细胞膜表面的GABRβ1蛋白表达明显低于空白对照组,表明具有统计学意义（P＜0.05）。其中Quinpirole组β1亚基蛋白表达量与空白对照组相比减少16.34%,水杨酸钠组GABRβ1亚基蛋白表达量与空白对照组比减少19.98%,SS+Quinpirole组β1亚基蛋白表达量与空白对照组比减少22.72%。在DR2激动剂Quinpirole组中加入DR2抑制剂Eticlopride后,或同时加入Eticlopride和蛋白激酶A抑制剂H-89,GABRβ1亚基胞膜蛋白表达量与对照组相比没有统计学意义。结果表明,Eticlopride和H-89可以减轻水杨酸钠、Quinpirole对GABRβ1亚基膜蛋白的抑制作用,即拮抗了多巴胺D2受体和蛋白激酶A作用后,阻断了Quinpirole对GABAAR的调控作用,抑制SS介导的GABAA受体的内化作用;GABRβ1总蛋白的表达量没有明显改变。结论:SS通过DR2触发GABAA受体的内吞,使GABAAR的胞膜表达量表达减少,减弱GABAAR介导的抑制性应答作用;DR2通过蛋白激酶A依赖的磷酸化途径介导水杨酸钠对GABAA受体的调节,在此过程中PKA负向调节GABAA受体功能,最终导致SGNs的兴奋毒性。
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