严重急性呼吸系统综合症(SARS)又称传染性非典型性肺炎，是一种严重的急性呼吸系统传染病。2002年11月首先暴发于我国的广东地区，并在几个月中迅速传播到数十个国家和地区。到2003年7月，全球病例高达8098例，死亡774人。SARS主要通过短距离飞沫、接触患者呼吸道分泌物及密切接触传播。临床上以起病急、发热、头痛、肌肉酸痛、乏力、干咳少痰、腹泻及白细胞减少为特征，严重者出现气促和呼吸窘迫。已成为危害人类健康和公共卫生的世界性难题。现在SARS冠状病毒仍大量存在于动物体内(果子狸，蝙蝠、老鼠等)，对真正的SARS冠状病毒的宿主仍有争议，并且也有少量的散发病例，所以SARS的再次爆发流行是有可能的。疫苗是防治传染病的最有效的途径之一，因此，SARS的疫苗研究是当前及相当长的一段时间内的重要任务。 SARS冠状病毒(SARS-CoV)为单股正链RNA病毒。基于其核酸序列和蛋白序列的系统进化显示该病毒并不属于冠状病毒现有的三种血清型，为一独立分支。SARS-CoV直径约为80-140nm。病毒核衣壳是单股正链RNA与衣壳蛋白N所形成的疏松结构，外有包膜，上嵌有三种糖蛋白，S蛋白(Spikeprotein)、M蛋白(Membraneprotein)和E蛋白(Envelopeprotein)，其中S蛋白在膜上排列成规则的冠状结构。S蛋白为刺突糖蛋白，参与病毒与宿主细胞表面的病毒受体结合并介导病毒通过膜融合进细胞的过程。M蛋白则和病毒包膜的形成和芽生密切相关。E蛋白则在病毒组装和芽生过程中起重要作用。N蛋白是SARS冠状病毒的一种重要结构蛋白，它在病毒的包装过程及病毒RNA的转录和复制过程中发挥重要作用。S、M、N蛋白是冠状病毒的主要抗原蛋白，其中又以S蛋白的研究为最多。SARS-CoV的结构以及当前的基因序列研究都为疫苗的研制提供了重要的理论依据。疫苗是遏制传染病流行的有效武器。疫苗经鼻腔途径免疫，在呼吸道黏膜表面可以产生sIgA对抗病原体的入侵，局部淋巴组织产生的CTL可以清除已经入侵的病原体。鼻腔黏膜免疫还可以引起系统性免疫应答反应。SARS主要通过呼吸道传播，因此滴鼻疫苗将是SARS疫苗研究的重点之一。我们利用SARS-CoVSDNA疫苗经鼻腔途径免疫Balb/c小鼠，然后体外监测SARS-CoVS特异性细胞和体液免疫应答，为SARS-CoVSDNA疫苗经鼻腔途径免疫的临床试验提供理论依据。 研究目的： 1.SARS-CoVSDNA疫苗经鼻腔黏膜途径免疫Balb/c小鼠后，研究其抗原特异性的细胞和体液免疫反应。 2.探讨免疫次数对免疫应答的影响，寻求最佳的免疫方案。 第一部分：鼻腔黏膜免疫后的特异性免疫反应 目的： 鼻腔途径免疫小鼠，观察其抗原特异性细胞和体液免疫反应 实验方法： 1.提取SARS-CoVSDNA质粒。 2.小鼠分为免疫组和对照组，免疫组经鼻腔途径滴入50ug/只SARS-CoVSDNA质粒。对照组经鼻腔途径滴入等量的PBS。 3.ELISA法检测小鼠脾脏和肺脏淋巴细胞分泌的细胞因子IFN-γ以及血清中的特异性抗体IgG；FACS在CD4和CD8细胞亚群水平分析细胞因子IFN-γ和IL-2的产生以及它们的关系。 4.各组间数据均用SPSS10.0软件进行t检验分析，p＜0.05为差异有统计学意义。 结果： 1.提取SARS-CoVSDNA质粒经琼脂糖凝胶电泳，电泳图上可见清晰明亮的条带；在核酸蛋白定量分析仪上测定其浓度为1.85mg/ml。 2.血清100倍稀释后，对照组小鼠的特异性IgG抗体滴度均值为0.23，SARS-CoVSDNA疫苗经鼻腔途径免疫后，小鼠的特异性IgG抗体滴度均值为0.60，血清1000倍稀释后对照组小鼠的特异性IgG抗体滴度均值为0.12，而免疫后的小鼠的特异性IgG抗体滴度均值为0.30。利用ELISA法检测细胞因子的产生，对照组小鼠脾脏淋巴细胞分泌的IFN-γ测不出，经鼻腔免疫后的小鼠脾脏淋巴细胞未经S混合多肽刺激后也测不出IFN-γ的产生，而经S混合多肽刺激后，IFN-γ的分泌量均值为150pg/ml；对照组小鼠肺脏淋巴细胞分泌的IFN-γ很低(7-13pg/ml)，经鼻腔免疫后的小鼠肺脏淋巴细胞未经S混合多肽刺激后IFN-γ的产生均值为70pg/ml，而经S混合多肽刺激后，IFN-γ的分泌量均值为485pg/ml。在脾脏，对照组小鼠CD4和CD8亚群FACS都测不出IFN-γ的产生，而免疫后的小鼠CD4和CD8亚群产生的特异性细胞因子IFN-γ量都增多(CD40.04％，CD80.09％)，肺脏的淋巴细胞分泌的细胞因子的结果和脾脏一致，但是产生特异性细胞因子IFN-γ量比脾脏稍多(CD40.12％，CD80.18％)；对照组小鼠CD4和CD8亚群FACS都测不出IL-2的产生，而免疫后的小鼠CD4和CD8亚群产生的特异性细胞因子IL-2量都增多(CD40.12％，CD80.06％)，肺脏的淋巴细胞分泌的细胞因子的结果和脾脏一致，但是产生特异性细胞因子IL-2量比脾脏稍多(CD40.15％，CD80.07％)。肺脏和脾脏的大部分CD4亚群细胞只分泌IFN-γ或者IL-2，只有小部分绌胞既表达IFN-γ又表达IL-2(脾脏CD40.04％，肺脏CD40.01％)。而肺脏和脾脏的CD8亚群大部分都分泌IFN-γ，只有小部分分泌IL-2，或者既表达IFN-γ又表达IL-2。 结论： 经鼻腔途径免疫，SARS-CoVSDNA疫苗可以引起Balb/c小鼠特异性细胞和体液免疫反应。 第二部分：探讨鼻腔黏膜免疫的次数对免疫效果的影响 目的： SARS-CoVSDNA疫苗经鼻腔途径免疫Balb/c小鼠，探讨免疫次数对免疫应答的影响，寻求最佳的免疫方案。 实验方法： 1.小鼠分为免疫组和对照组，免疫组又分为免疫一次组(只免疫一次)，加强一次组(免疫两次)和加强两次组(免疫三次)。免疫组经鼻腔途径滴入50ug/只SARS-CoVSDNA质粒。对照组经鼻腔途径滴入等量的PBS。 2.ELISA检测不同免疫次数后的小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ的产生，ELISPOT检测不同免疫次数后的小鼠脾脏淋巴细胞中抗原特异性T细胞的频数。 3.各组间数据均用SPSS10.0软件进行t检验分析，p＜0.05为差异有统计学意义。 结果： 我们比较了SARS-CoVSDNA疫苗经鼻腔途径免疫小鼠后不同免疫次数组的免疫反应，初次免疫后小鼠脾脏淋巴细胞经混合多肽刺激后细胞因子IFN-γ产生ELISA方法测不出，产生抗体IgG的OD值为0.16；加强一次后IFN-γ分泌量为120pg/ml，产生抗体IgG的OD值为0.38；加强两次后IFN-γ分泌量为420pg/ml，产生抗体IgG的OD值为0.51。ELISPOT结果显示初次免疫后小鼠脾脏淋巴细胞经混合多肽刺激后2x106个淋巴细胞中抗原特异性T细胞产生的斑点数均值为33个，加强1次后为63个，加强2次后为为80个。 结论： 加强免疫后细胞因子IFN-γ和特异性抗体IgG的产生都有明显增高，说明鼻腔免疫不同次数对免疫效果有影响，SARS-CoVSDNA疫苗经鼻腔途径加强后免疫效果较佳。